|
|
Proteins interacting with oxygen and its reactive species in Naegleria gruberi
Malych, Ronald ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Rohlena, Jakub (oponent)
Naegleria gruberi je volně žijící nepatogenní améba. Je to blízký příbuzný patogenní Naegleria fowleri, která způsobuje primární amébovou meningoencefalitidu u lidí (PAM). Jako volně žijící organismus je Naegleria gruberi přizpůsobena aerobnímu způsobu života, ale má také některé pozoruhodné rysy anaerobního organismu, jako je např. přítomnost Fe-Fe hydrogenázy, která je schopná produkce vodíku. Tato práce se zaměřuje na tři typy železo obsahujících proteinů, interagujících s kyslíkem a jeho reaktivními formami (ROS), které byly odhaleny v genomu N. gruberi - hemerythrin, protoglobin a rubrerythrin. Studované proteiny byly izolovány a purifikovány jako rekombinantní proteiny, proti kterým byly vytvořeny protilátky. V genomu N. gruberi nalezený jediný homolog rubrerythrinu jsme úspěšně lokalizovali v mitochondrii, na rozdíl od hemerythrinu a protoglobinu, které vykazují cytosolickou lokalizaci. Charakterizace těchto rekombinantních proteinů in vitro zahrnovala hlavně chromatografii na molekulárních sítech a UV-vis spektrofotometrii. Schopnost vázat kyslík byla prokázána spektrálními změnami rekombinantního hemerythrinu, purifikovaného za anaerobních podmínek, a rekombinantního protoglobinu, izolovaného aerobně. Analýza western blot odhalila změny exprese těchto proteinů v N. gruberi kultivovaných se...
|
|
|
Metabolismus mědi u patogenních eukaryotických mikroorganismů
Doležalová, Taťána ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Pilátová, Jana (oponent)
Měď je esenciální prvek pro takřka všechny živé organismy. Její zásadní role v metabolismu je dána především redoxními vlastnostmi tohoto kovu. Díky tomu je to cenný kofaktor mnoha enzymů, které se podílejí na energetickém metabolismu buňky, ale také na detoxifikaci reaktivních forem kyslíku. Přesto měď může při příliš vysoké koncentraci buňkám spíše uškodit. Její toxické působení se projevuje především tvorbou hydroxylových radikálů, které narušují buněčné struktury. Dochází i k poškozování Fe-S center, která jsou nepostradatelná pro mnoho enzymů. Aby nedošlo k projevům toxicity, musí každá buňka balancovat na hraně mezi přiměřeným příjmem a regulovaným výdejem mědi. Řada specializovaných přenašečů a ATPáz slouží výhradně pro transport mědi. Stejně tak najdeme metallochaperony, které vážou potenciálně toxické kovy a transportují je k cílovému proteinu. Případně je zajímavý úděl metallothioneinů, které vyvazují cytosolickou měď. Pochopení udržování homeostázy mědi u patogenních organismů přináší mnoho zajímavých možností pro lepší cílenou léčbu onemocnění. Například nemoci způsobené oportunistickými houbami jako je Candida albicans, Aspergillus fumigatus nebo Cryptococcus neoformans mají významný podíl na úmrtích imunodeficientních pacientů. Jelikož jsou některé dráhy metabolismu mědi u eukaryot...
|
|
|
Antiparazitický a antimykotický účinek různých chelátorů železa
Šipková, Anna ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Kuthan, Martin (oponent)
Železo je klíčovým prvkem pro správnou funkci různých metabolických procesů v buňce. Může být ale ve vyšších koncentracích pro buňku toxické, proto je homeostáza železa v buňce přísně regulována. Tento prvek mimo jiné sehrává důležitou roli v interakci mezi parazitem a hostitelem. Parazitické organismy jsou závislé na příjmu železa z hostitelského prostředí. Příjem železa je pro parazita velmi náročný vzhledem k sofistikovaným metodám sekvestrace zásob železa hostitelem. Získané železo je ve vysoké míře transportováno do mitochondrie, kde je nezbytné pro správnou funkci. Práce se zaměřuje na výzkum vlivu modifikovaných chelatačních látek na patogenní houby a vybrané parazitické organismy třídy Kinetoplastida, způsobující závažná onemocnění u lidí. Díky vznikajícím rezistencím k léčivům jsou tyto patogeny velkou hrozbou. Modifikované chelatační látky umožňují cílit na funkci mitochondrií a ovlivňovat homeostázu železa, což by mohlo mít výrazný antiparazitický a antimykotický účinek. Modifikované chelátory jsou u testovaných organismů schopny zastavit jejich růst i v nM koncentracích, ovlivnit mitochondriální respiraci, membránový potenciál a permeabilitu membrán. Cílením látek do mitochondrie se mnohonásobně zvýšil účinek původních chelátorů. Do výzkumu byla zahrnuta i nově objevená látka halicin,...
|
|
|
Proteins interacting with oxygen and its reactive species in Naegleria gruberi
Malych, Ronald ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Rohlena, Jakub (oponent)
Naegleria gruberi je volně žijící nepatogenní améba. Je to blízký příbuzný patogenní Naegleria fowleri, která způsobuje primární amébovou meningoencefalitidu u lidí (PAM). Jako volně žijící organismus je Naegleria gruberi přizpůsobena aerobnímu způsobu života, ale má také některé pozoruhodné rysy anaerobního organismu, jako je např. přítomnost Fe-Fe hydrogenázy, která je schopná produkce vodíku. Tato práce se zaměřuje na tři typy železo obsahujících proteinů, interagujících s kyslíkem a jeho reaktivními formami (ROS), které byly odhaleny v genomu N. gruberi - hemerythrin, protoglobin a rubrerythrin. Studované proteiny byly izolovány a purifikovány jako rekombinantní proteiny, proti kterým byly vytvořeny protilátky. V genomu N. gruberi nalezený jediný homolog rubrerythrinu jsme úspěšně lokalizovali v mitochondrii, na rozdíl od hemerythrinu a protoglobinu, které vykazují cytosolickou lokalizaci. Charakterizace těchto rekombinantních proteinů in vitro zahrnovala hlavně chromatografii na molekulárních sítech a UV-vis spektrofotometrii. Schopnost vázat kyslík byla prokázána spektrálními změnami rekombinantního hemerythrinu, purifikovaného za anaerobních podmínek, a rekombinantního protoglobinu, izolovaného aerobně. Analýza western blot odhalila změny exprese těchto proteinů v N. gruberi kultivovaných se...
|
|
|
Homeostáza železa u malárie
Wernerová, Klára ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Voleman, Luboš (oponent)
Ačkoliv je malárie značně zkoumaným infekčním onemocněním, stále s ní nedokážeme dostatečně účinně bojovat, o čemž vypovídá poměrně vysoký počet nakažených. Existuje sice množství antimalarik, nicméně na řadu z nich vzniká rezistence, proto je třeba vyvíjet nová, účinnější léčiva. Jednou z možností je zacílit na parazitův metabolismus železa, esenciálního prvku všech organismů. Železo se účastní syntézy DNA, dýchání a výroby energie. Funguje jako kofaktor ribonukleotid reduktázy, metaloproteinů s FeS klastry nebo hemem. Během infekce musí paraziti s hostitelem bojovat o potřebné látky, a tedy také o železo. Mechanismus příjmu nebo vylučování železa u původce malárie není zatím zcela jasný, jsou známé pouze 2 transportéry železa a již nyní je zřejmé, že jich musí být více. Parazit rodu Plasmodium tráví velké množství hemoglobinu, který je následně degradován na volný hem a denaturovaný globin. Volný hem je však pro buňku toxický. Plasmodium se toxicitě volného hemu brání tvorbou chemicky inertního hemozoinu. Tento unikátní mechanismus ochrany před toxicitou volného hemu je pro Plasmodium i ostatní krevní parazity velice výhodný, protože ho však nesdílí se svým hostitelem, stává se rovněž výhodným cílem pro léčiva. Další možností chemoterapie je použití chelátorů železa. Chelátory vykazují dvojí...
|
|
|
Oxidativní stres u patogenních améb
Plíva, Jan ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Smutná, Tamara (oponent)
Reaktivní formy kyslíku jsou látky, které obsahují atom kyslíku s nepárovým elektronem. Díky tomuto nepárovému elektronu jsou tyto formy kyslíku značně reaktivní. Organismy využívají reaktivitu těchto látek k nepřebernému množství reakcí. Buňky jsou schopny vytvářet reaktivní formy kyslíku jako odpadní produkt během aerobní respirace, nebo pomocí enzymů, například NADPH oxidázy. Velmi důležitou roli hrají reaktivní formy kyslíku při obraně hostitele před parazitickými organismy. Během těchto obranných reakcí jsou reaktivní formy kyslíku využívány ve velké míře buňkami imunitního systému k destrukci parazitických organismů. K těmto reakcím dochází i v případě infekce způsobené patogenními amébami. Améby jsou eukaryotické jednobuněčné organismy, které jsou v některých případech schopny u člověka vyvolávat velmi vážná onemocnění. Améby musí být schopny během infekce překonat imunitní systém hostitele a tím pádem i reaktivní formy kyslíku. Proto využívají detoxifikační systémy, které jim pomáhají vypořádat se s oxidativním stresem způsobeným reaktivními formami kyslíku. Patogenní améby jsou ovšem schopny využít reaktivní formy kyslíku k překonání imunitního systému hostitele. Tato skutečnost potvrzuje jak spletité a komplikované je působení reaktivních forem kyslíku během interakce mezi hostitelským organismem...
|
|
|
Role of sulfhydryl oxidase 1 in cancerogenesis
Beranová, Lea Marie ; Truksa, Jaroslav (vedoucí práce) ; Šuťák, Róbert (oponent)
Cysteinové můstky hrají významnou roli při sbalování proteinů do nativní konformace, stejně jako v regulaci enzymové aktivity a účastní se tak mnoha intracelulárních, avšak i extracelulárních, dějů. Sulfhydryl oxidáza QSOX1 pomáhá tyto můstky de novo vytvářet čímž ovlivňuje aktivitu svých substrátů a přímo či nepřímo tím reguluje životně důležité procesy v buňce. Cílem této práce bylo prozkoumat roli QSOX1 v karcinogenzi a to především u buněk nádorů prsu (MCF7, MDA-MB-231) a slinivky břišní (Panc-1) a zároveň objasnit možnou spojitost mezi koncentrací kyslíku v rámci nádorového mikroprostředí a hladinou QSOX1 na proteinové i mRNA úrovni. Vytvořením dvou typů geneticky modifikovaných linií (QSOX1-overexprimující a QSOX1-knockout linie) byl pozorován pozitivní vliv QSOX1 na proliferaci trojnásobně negativních nádorových buněk MDA-MB-231. Buňky nevytvářející QSOX1 projevují nižší tendenci k proliferaci, zatímco nadbytek tohoto pro- teinu na tempo růstu vliv zdá se nemá. Nedostatek QSOX1 má také za následek viditelnou změnu v morfologii buňky, kdy dochází ke smrštění do kulovitějších útvarů s méně znatelnými lamelipodii, či jejich naprostou ab- sencí, což je v souladu s teorií důležitosti...
|
|
|
Metabolismus mědi u Naegleria gruberi
Ženíšková, Kateřina ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Pyrih, Jan (oponent)
Měď je důležitý stopový prvek esenciální pro všechny organismy. Ve formě kofaktoru se účastní klíčových biochemických reakcí. Zprostředkovává například přenos elektronu v komplexu IV v rámci dýchacího řetězce, ve formě kofaktoru superoxiddismutasi se účastní detoxifikace hydroxylových radikálů a participuje na příjmu iontů železa do buňky. Homeostáze iontů mědi musí být přísně regulována, aby bylo zabráněno jejich akumulaci v organismu. Nadbytek těchto iontů je totiž vysoce toxický a může vést až k buněčné smrti. Ionty mědi se podílejí na vzniku hydroxylových radikálů, nebezpečných zástupců reaktivních forem kyslíku poškozujících strukturu lipidů, proteinů a DNA. Mnohé studie také ukazují důležitou roli iontů mědi při virulenci, kdy je těmito ionty indukovaná imunitní odpověď napadeného hostitele. Vliv dostupnosti mědi na metabolismus byl studován na organismu Naegleria gruberi. Osekvenovaný genom tohoto organismu odhaluje, že metabolické dráhy N. gruberi jsou velmi univerzální. Možná flexibilita metabolismu tohoto organismu, v souvislosti s dostupností mědi, byla v této práci potvrzena proteomickou analýzou a měřením aktivity respiračního řetězce. Byla také potvrzena závislost příjmu iontů železa na mědi. Druhá část této práce se zabývala studiem proteinu CutC. Tento protein se řadí do skupiny...
|
|
|
Metabolismus železa u Naegleria gruberi
Arbon, Dominik ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Krijt, Matyáš (oponent)
Metabolismus iontů železa patří mezi zásadní děje ve všech živých organismech a jeho správná regulace je podstatná pro základní životní funkce. Homeostáze iontů tohoto kovu je úzce regulovaná, vyskytuje se většinou jako součást různých proteinů a podílí se na mnoha oxidačně redukčních dějích. Naegleria gruberi je nepatogenní, volně žijící prvok, který slouží jako laboratorní model pro studium blízce příbuzné patogenní Naegleria fowleri. Tato práce se zabývá studiem vybraných metabolitů u N. gruberi, které bylo možné detekovat a kvantifikovat pomocí moderních metabolomických metod a popsat ovlivnění jejich exkrece v kultuře kultivované v prostředí s nedostatkem iontů železa. Zjištění vlivu tohoto prostředí na energetický metabolismus prvoka patří mezi důležité aspekty pochopení biologických procesů na buněčné úrovni. Tímto způsobem se podařilo prokázat signifikantní ovlivnění exkrece některých metabolitů a prokázat flexibilitu metabolických drah jako následek snížené přítomnosti iontů železa. Další část této práce se věnuje enzymu alkoholdehydrogenáze, který byl objeven u tohoto prvoka. Mezi netypické znaky enzymu patří N-terminální mitochondriální presekvence, napovídající o mitochondriální lokalizaci enzymu, a vazba iontů železa jako prostetické skupiny. U N. fowleri se tento enzym nenachází, což...
|
|
|
FeS cluster assembly in cytosol of Trichomonas vaginalis
Stojanovová, Darja ; Tachezy, Jan (vedoucí práce) ; Šuťák, Róbert (oponent)
Železo-sirné klastry jsou kofaktory celé řady významných proteinů. Pro studium syntézy těchto klastrů se využívají především modelové organismy typu Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens a v poslední době také Trypanosoma brucei. U Trichomonas vaginalis, anaerobního prvoka, který parazituje v urogenitálním traktu lidí, však nebylo toto téma studováno více do hloubky. T. vaginalis patří mezi anaeroby, jejichž mitochondrie byla redukována na hydrogenosom. V této organele již byly identifikované některé komponenty ISC dráhy pro syntézu klastrů, zatímco proteiny, které se účastní CIA dráhy v cytosolu, nebyly u T. vaginalis doposud charakterizovány. Tato práce se zabývá především TvIscU, jedním z hlavních proteinů ISC dráhy, a dále také komponenty CIA dráhy. Oba dva typy syntézy klastrů, jak v hydrogenosomech tak i v cytosolu, se zásadně liší od typického modelu založeném na studiu S. cerevisce. V této práci jsme studovali hypotetické funkční propojení ISC-CIA systému. Dále jsme identifikovali homology k charakterizovaným proteinům účastnících se CIA dráhy. Konkrétně jsme identifikovali Nbp35, Cfd1, Nar1, Cia1 Cia2, avšak nenalezli jsme proteiny homologní pro Tah18, Dre2 a Mms19. Nalezené proteiny jsme v T. vaginalis exprimovali značené Ha-tagem a lokalizovali je v buněčných frakcích a pomocí...
|
host ::
RSS.