|
|
Značení T buněk bimodální kontrastní látkou pro studium mrtvice in vivo
Krijt, Matyáš ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Kříž, Jan (oponent)
Mrtvice je závažné mozkové poranění, které může mít za následek náhlou smrt nebo trvalé neurologické poškození. V současnosti je k dispozici jediná účinná léčba pomocí tkáňového aktivátoru plasminogenu. Jedním z nových potenciálních cílů léčby jsou T buňky. Ačkoliv mnohé studie přisuzují úlohou T buněk v patogenezi ischemické mozkové příhody, množství i časový průběh infiltrace všech podtypů T buněk do místa mozkové léze není zcela znám. Výzkum v této oblasti je limitován nedostatkem metod vhodných pro in vivo sledování buněk. Z tohoto důvodu bylo cílem této práce vytvořit metodu pro značení T buněk MRI kontrastní látkou za účelem sledování distribuce T buněk pomocí in vivo MRI u myší s indukovanou ischemií. T buňky byly izolovány z C57/BL6 myšího kmene ve dvoukrokovém izolačním protokolu pomocí gradientové centrifugace a magnetické separace s 97% výtěžkem. Izolované buňky byly značeny kontrastní látkou Molday ION Rhodamine B o koncentraci 100 μg Fe/mL. Úspěšnost značení po 17-ti hodinách inkubace byla vyšší než 99 %. Značené buňky byly kultivovány s CD3 a CD28 protilátkami. Viabilita značených T buněk byla 74 % v porovnání s 83 % viabilitou neznačených buněk. Označené T buňky byly zobrazeny pomocí fluorescenční mikroskopie a magnetické rezonance. Mrtvice u myší byla indukována okluzí střední...
|
|
|
Role železa ve virulenci Acanthamoeba castellanii
Šimáčková, Aneta ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Krijt, Matyáš (oponent)
Železo je nezbytná živina pro všechny živé organismy. Má zásadní úlohu ve virulenci patogenních bakterií i parazitických eukaryot. I když je železo hojným prvkem v organismu hostitele, není pro parazita snadné ho získat. Schopnost parazitů vyvolat onemocnění závisí z velké části na tom, jak účinné mechanismy pro zisk železa vyvinuli. Tato práce se zabývá vlivem železa na virulenci Acanthamoeba castellanii. Je to volně žijící améba, která za výjimečných situací může u člověka vyvolat smrtelné zánětlivé onemocnění mozku nebo člověku poškodit zrak. Kultivací se savčími buňkami se nám povedlo prokázat vliv železa na virulenci améby za využití průtokové cytometrie. Na základě fluorescenčního značení jsme lokalizovali protein AC_IDIP (Iron-Deprivation Induced Protein) v cytosolu. Tento protein byl také izolován a byla proti němu vytvořena polyklonální protilátka, která byla použita ke sledování vlivu dostupnosti železa na hladinu AC_IDIP. Pomocí komparativní proteomické analýzy jsme byli schopni sledovat změny v proteomu A. castellanii v závislosti na zdroji živin. Identifikovali jsme velké množství proteinů, jež měly změněnou hladinu za podmínky, kde zdrojem živin byly savčí buňky. Jednalo se zejména o cytoskeletální proteiny. Oproti tomu zastoupení proteinů obsahujících železo, nebo se na jeho...
|
|
|
Úloha exosomů u chronické myeloidní leukemie
Březinová, Lenka ; Krijt, Matyáš (vedoucí práce) ; Holada, Karel (oponent)
Exosomy jsou extracelulární váčky o velikosti 30-150 nm, jejichž funkce je u chronické myeloidní leukemie (CML) zkoumaná kvůli jejich vlivu na proliferaci CML buněk, remodelaci kostní dřeně, angiogenezi a rezistenci na léčbu tyrosin-kinázovými inhibitory (TKIs). Ačkoliv byly vyvinuty účinné TKIs inhibující BCR-ABL kinázu, přesto zůstává 20-30 % pacientů na léčbu rezistentní. Rezistence CML buněk na léčbu je podporována exosomy. Exosomy přenášejí proteiny, nukleové kyseliny, chemokiny i malé molekuly, které podporují antiapoptotické, respektive tlumí proapoptotické procesy. Antiapoptotické procesy jsou podporovány zejména zvýšenými hladinami proteinů: TGF-β1, USP6 a FGF2 a různorodých zástupců RNA: miR-365, miR-21, Hsa_circ_0058493 a mRNA pro BCR-ABL. Snaha leukemických buněk je naopak snížit množství proapoptotických molekul, mezi které patří miR-320, miR-328 a miR-146a-5p. Leukemické buňky prostřednictvím exosomů modifikují mikroprostředí kostní dřeně tak, aby je podporovalo, a dále ovlivňují expresi adhezních a proangiogenních molekul. Důležitou roli v těchto procesech hrají miR-126, miR-210 a miR-92a. Vzhledem k variabilitě přenášených molekul není překvapující množství procesů ovlivněných CML exosomy ani jejich potenciální využití v léčbě CML, jak již bylo dokázáno v případě využití...
|
|
|
Pathology and physiology of de novo purine synthesis
Krijt, Matyáš
Puriny jsou organické sloučeniny s rozmanitými funkcemi, které se nacházejí ve všech živých organismech ve složitých molekulách, jako jsou nukleotidy, nukleosidy nebo jako purinové báze. Jejich přirozená rovnováha v organismu je udržována syntézou, recyklací a degradací. Přebytek purinů se vylučuje močí jako kyselina močová. Purinové nukleotidy mohou být recyklovány záchrannými cestami, které katalyzují reakci purinové báze s fosforibosylpyrofosfátem. Zcela nová ústřední molekula purinového metabolismu, inosinmonofosfát, může být syntetizována z prekurzorů při de novo purinové syntéze (DNPS), která je aktivována v případech zvýšené potřeby purinů jako je např. vývoj organismu. DNPS zahrnuje deset kroků katalyzovaných šesti enzymy, které formují multienzymový komplex purinosom umožňující tok substrátů skrz tuto dráhu. Dosud byly popsány tři poruchy DNPS: deficit ADSL, AICA-ribosidurie a deficit PAICS. Všechny tři poruchy jsou způsobeny genetickými mutacemi vedoucími ke špatné funkci příslušného enzymu, které se dále projevují nedostatečnou aktivitou daného kroku DNPS. Biochemicky to znamená akumulaci substrátu poškozeného enzymu, biologicky narušení formování purinosomu a klinicky nespecifická neurologická postižení, což přispívá k problematické diagnostice poruch DNPS. Předpokládali jsme, že...
|
|
|
Pathology and physiology of de novo purine synthesis.
Krijt, Matyáš ; Zikánová, Marie (vedoucí práce) ; Šebesta, Ivan (oponent) ; Čajka, Tomáš (oponent)
Puriny jsou organické sloučeniny s rozmanitými funkcemi, které se nacházejí ve všech živých organismech ve složitých molekulách, jako jsou nukleotidy, nukleosidy nebo jako purinové báze. Jejich přirozená rovnováha v organismu je udržována syntézou, recyklací a degradací. Přebytek purinů se vylučuje močí jako kyselina močová. Purinové nukleotidy mohou být recyklovány záchrannými cestami, které katalyzují reakci purinové báze s fosforibosylpyrofosfátem. Zcela nová ústřední molekula purinového metabolismu, inosinmonofosfát, může být syntetizována z prekurzorů při de novo purinové syntéze (DNPS), která je aktivována v případech zvýšené potřeby purinů jako je např. vývoj organismu. DNPS zahrnuje deset kroků katalyzovaných šesti enzymy, které formují multienzymový komplex purinosom umožňující tok substrátů skrz tuto dráhu. Dosud byly popsány tři poruchy DNPS: deficit ADSL, AICA-ribosidurie a deficit PAICS. Všechny tři poruchy jsou způsobeny genetickými mutacemi vedoucími ke špatné funkci příslušného enzymu, které se dále projevují nedostatečnou aktivitou daného kroku DNPS. Biochemicky to znamená akumulaci substrátu poškozeného enzymu, biologicky narušení formování purinosomu a klinicky nespecifická neurologická postižení, což přispívá k problematické diagnostice poruch DNPS. Předpokládali jsme, že...
|
|
|
Metabolismus železa u Naegleria gruberi
Arbon, Dominik ; Šuťák, Róbert (vedoucí práce) ; Krijt, Matyáš (oponent)
Metabolismus iontů železa patří mezi zásadní děje ve všech živých organismech a jeho správná regulace je podstatná pro základní životní funkce. Homeostáze iontů tohoto kovu je úzce regulovaná, vyskytuje se většinou jako součást různých proteinů a podílí se na mnoha oxidačně redukčních dějích. Naegleria gruberi je nepatogenní, volně žijící prvok, který slouží jako laboratorní model pro studium blízce příbuzné patogenní Naegleria fowleri. Tato práce se zabývá studiem vybraných metabolitů u N. gruberi, které bylo možné detekovat a kvantifikovat pomocí moderních metabolomických metod a popsat ovlivnění jejich exkrece v kultuře kultivované v prostředí s nedostatkem iontů železa. Zjištění vlivu tohoto prostředí na energetický metabolismus prvoka patří mezi důležité aspekty pochopení biologických procesů na buněčné úrovni. Tímto způsobem se podařilo prokázat signifikantní ovlivnění exkrece některých metabolitů a prokázat flexibilitu metabolických drah jako následek snížené přítomnosti iontů železa. Další část této práce se věnuje enzymu alkoholdehydrogenáze, který byl objeven u tohoto prvoka. Mezi netypické znaky enzymu patří N-terminální mitochondriální presekvence, napovídající o mitochondriální lokalizaci enzymu, a vazba iontů železa jako prostetické skupiny. U N. fowleri se tento enzym nenachází, což...
|
|
|
Značení T buněk bimodální kontrastní látkou pro studium mrtvice in vivo
Krijt, Matyáš ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Kříž, Jan (oponent)
Mrtvice je závažné mozkové poranění, které může mít za následek náhlou smrt nebo trvalé neurologické poškození. V současnosti je k dispozici jediná účinná léčba pomocí tkáňového aktivátoru plasminogenu. Jedním z nových potenciálních cílů léčby jsou T buňky. Ačkoliv mnohé studie přisuzují úlohou T buněk v patogenezi ischemické mozkové příhody, množství i časový průběh infiltrace všech podtypů T buněk do místa mozkové léze není zcela znám. Výzkum v této oblasti je limitován nedostatkem metod vhodných pro in vivo sledování buněk. Z tohoto důvodu bylo cílem této práce vytvořit metodu pro značení T buněk MRI kontrastní látkou za účelem sledování distribuce T buněk pomocí in vivo MRI u myší s indukovanou ischemií. T buňky byly izolovány z C57/BL6 myšího kmene ve dvoukrokovém izolačním protokolu pomocí gradientové centrifugace a magnetické separace s 97% výtěžkem. Izolované buňky byly značeny kontrastní látkou Molday ION Rhodamine B o koncentraci 100 μg Fe/mL. Úspěšnost značení po 17-ti hodinách inkubace byla vyšší než 99 %. Značené buňky byly kultivovány s CD3 a CD28 protilátkami. Viabilita značených T buněk byla 74 % v porovnání s 83 % viabilitou neznačených buněk. Označené T buňky byly zobrazeny pomocí fluorescenční mikroskopie a magnetické rezonance. Mrtvice u myší byla indukována okluzí střední...
|
|
|
Příprava analogů MRI kontrastních látek a studium jejich internalizace na buněčných kulturách
Krijt, Matyáš ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Martínková, Eva (oponent)
Magnetická rezonance je neinvazivní metoda běžně využívaná pro vyšetření vnitřních orgánů a měkkých tkání. Za účelem zvýšení intenzity a zlepšení specificity byly vyvinuty kontrastní látky, které ovlivňují T1- a T2-relaxační časy. Většina T1-kontrastních látek jsou komplexní sloučeniny trojmocného gadolinia. Cílem této práce bylo připravit analogické komplexní sloučeniny k dnes používaným Gd(III) kontrastním látkám záměnou centrálního atomu gadolinia za atom europia a využít jeho fluorescenčních vlastností ke sledování buněčné-distribuce kontrastních látek. Kvůli silné auto-fluorescenci použitých buněčných kultur však nebylo možné přesně definovat biologický osud europitých komplexů. Dále byly získány údaje ohledně toxicity pomocí průtokového cytometru a údaje o výskytu europia v buňkách pomocí elementární analýzy (ICP-MS).
|
host ::
RSS.