|
|
Modification of nucleic acids by reactive groups for bioconjugations and cross-linking with lysine-containing peptides and proteins
Ivancová, Ivana ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent) ; Urban, Milan (oponent)
V první části dizertační práce jsem vyvinula reaktivní DNA sondu pro selektivní cross- linkování s lysinovými zbytky DNA vazebních proteinů. Připravila jsem 2'-deoxycytidin 5'-O- monofosfát a trifosfát nesoucí v poloze 5 squramátovou skupinu navázanou přes propargylaminovou spojku. Monofosfát byl použit jako modelová sloučenina na testování reaktivity tohoto smíšeného squaramátu v cross-linkových reakcích s lysinem a krátkými peptidy obsahujícími lysin. Squaramátem modifikovaný 2'-deoxycytidin 5'-O-trifosfát byl dobrým substrátem pro KOD XL polymerázu pro enzymovou syntézu DNA metodou extenze primeru (PEX) a taky metodou polymerázové řetězové reakce (PCR). Squaramátem modifikovaná DNA tvoří stabilní diamidové vazby s primárními aminy. Reaktivitu modifikované DNA jsem testovala v biokonjugačních reakcích se sulfo-Cy5- aminem a s peptidy obsahujícími lysin. Poté byla squaramátem modifikovaná DNA úspěšně kovalentně připojena k histonovým proteinům bohatým na lysin. Reaktivní, squaramátem modifikovaný nukleotid vykazoval potenciál pro další biokonjugační reakce nukleových kyselin s aminy nebo lysin obsahujícími peptidy a proteiny bez potřeby externího činidla. Na základě pozitivních výsledků experimentů se squaramátem modifikovanou DNA, jsem v druhé části práce vyvinula a připravila squaramátem...
|
|
|
Modifications of DNA by reactive groups for bioconjugations and cross-links with arginine-containing peptides and proteins
Leone, Denise Liu ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Urban, Milan (oponent) ; Vrábel, Milan (oponent)
SOUHRN Tato disertační práce popisuje vývoj a syntézu DNA-reaktivních vláken nesoucích 1,3-diketonové nebo fenylglyoxalové části, které lze použít pro spojování s peptidy nebo proteiny obsahujícími arginin. Obecná strategie byla založena na funkcionalizaci polohy 5 u pyrimidinů prostřednictvím vodné Sonogashirovy reakce nebo click reakce (CuAAC) s reaktivními stavebními bloky pro syntézu modifikovaných 2'-deoxyribonukleosid monofosfátů a trifosfátů (dNMP/dNTPs). Následujícím krokem bylo enzymatické začlenění takto funkcionalizovaných dNTPs do DNA prostřednictvím metody prodlužování primeru (PEX). Paralelně byly monofosfátové deriváty použity jako modelové sloučeniny pro reakce s argininem a peptidy obsahujícími arginin pro testování reaktivity na vláknech DNA. Pro reaktivní kandidáty byly provedeny modelové reakce na modifikované DNA s argininem nebo peptidy obsahujícími Arg a následně byly DNA vlákna použity v reakcích s DNA-vazebnými proteiny bohatými na Arg. Vývoj takových vláken DNA nebyl přímočarý, ale vyžadoval zkoumání různých kandidátů. Nejdůležitějším bodem a zároveň výzvou při návrhu reaktivních stavebních bloků bylo nalezení rovnováhy mezi reaktivitou a stabilitou reaktivní skupiny. Prvním kandidátem byla glyoxylamidová skupina maskovaná thiazolidinem. Bohužel se ukázalo, že tento kandidát je...
|
|
|
Tandem Anionic Sigmatropic Rearrangement/Radical Reactions and Their Application Toward the Total Synthesis of Natural Products
Šimek, Michal ; Jahn, Ullrich (vedoucí práce) ; Urban, Milan (oponent) ; Švenda, Jakub (oponent)
SOUHRN Disertační práce popisuje vývoj bezprecedentních tandemových reakcí, spojujících anionický sigmatropní přesmyk s jednoelektronovou oxidací vzniklého enolátu pomocí ferrocenium hexafluorofosfátu. Generované radikály v α-pozici karbonylové skupiny byly oxygenovány jejich kaplingem s perzistentním radikálem TEMPO a poskytnuly přesmyknuté karbonylové sloučeniny s aminoxy skupinou v α-pozici. Byly nalezeny vhodné reakční podmínky a stanoveny faktory ovlivňujcící tendenci k přesmyku. Získané polyfunkční produkty se ukázaly jako všestranné při diverzifikaci polárními reakcemi poskytující ruzné struktury. Přesmyknuté α-aminoxy karbonylové sloučeniny s dvojnou vazbou v δ-pozici karbonylové skupiny jsou použitelné v celouhlíkaté 5-endo-trig cyklizaci řízené perzistentním radikálovým efektem. Byl studován rozsah reakce, včetně kompetitivních cyklizačních režimů. Vyvinutá metodologie byla využita při klíčovém reakčním kroku v syntéze vhodně substituovaného cyklopentanového jádra v divergentním přístupu k meroterpenoidním metabolitům izolovaným z houby Ganoderma applanatum. Provedená syntéza applanatumolů V a W a jejich epimerů umožnila korekci původně navržené stereochemie applanatumolu V. Dále bylo úspěšně dosaženo totální syntézy applanatumolu B. Spirocyklizační reakce na uhlíkatém skeletu umožnila syntézu...
|
|
|
Design, Synthesis, and Application of Novel Bifunctional (Thio)urea Organocatalysts Derived from Saccharides & Catalytic Asymmetric C−H Arylation of (η6-Arene)Chromium Complexes
Gergelitsová, Ivana ; Veselý, Jan (vedoucí práce) ; Sedlák, Miloš (oponent) ; Urban, Milan (oponent)
Tato disertační práce se v první části zabývá návrhem, přípravou, evaluací a využitím nových bifunkčních (thio)močovinových organokatalyzátorů odvozených od sacharidů. Kombinace (thio)močoviny (donoru vodíkové vazby) a Lewisovy báze na chirálním nosiči (např. 1,2-trans- cyclohexanu, chininových alkaloidech, 1,1'-binaftalenu) se v návrhu bifunkčních organo- katalyzátorů stala oblíbeným motivem. Dosud byla syntéze organokatalyzátorů, používajících jako chirální nosič sacharidy, věnována pouze omezená pozornost. Sacharidy jsou snadno dostupné v několika diastereomerních formách, a navíc nabízejí možnost změny sterických a elektronických vlastností a rozpustnosti skrze změnu O-substituentů. Byly navrženy tři typy nových organokatalyzátorů odvozených od sacharidů: C2-symetrické thiomočoviny/terciární aminy odvozené pouze od 2-amino-2-deoxy sacharidů, thiomočoviny/primární aminy tvořené pentopyranosovým a cyclohexanovým skeletem a (thio)močoviny/terciární fosfiny obsahující sacharidovou a α-aminokyselinovou jednotku. Sacharidová jednotka katalyzátorů prvního typu nese obě funkční skupiny a je tak jediným prvkem, který plně určuje stereoselektivitu. Takový přístup je v organokatalýze ojedinělý, jelikož naprostá většina organokatalyzátorů odvozených od sacharidů využívá sacharidovou jednotku pouze jako...
|
|
|
Role of brassinosteroids in plant response to drought stress
Trubanová, Nina ; Rothová, Olga (vedoucí práce) ; Urban, Milan (oponent)
Brassinosteroidy sú steroidné fytohormóny so širokým spektrom účinkov. Pri vystavení rastlín stresu suchom zlepšujú ich prežitie a zvyšujú odolnosť, a tým aj výnos. Odpoveď rastlín regulujú priamo (syntézou metabolitov) a/alebo nepriamo (indukciou antioxidačných zlúčenín a enzýmov), často v interakcii s inými fytohormónami. Experimenty študujúce vplyv brassinosteroidov na reakciu rastlín stresovaných vodným deficitom sa líšia v rôznych parametroch. Ich správna interpretácia je preto zložitá.
|
|
|
Application of fluoroalkyl hypervalent iodine reagents in C-H functionalization of small molecules and aromatic amino acid residues
Rahimidashaghoul, Kheironnesae ; Beier, Petr (vedoucí práce) ; Kvíčala, Jaroslav (oponent) ; Urban, Milan (oponent)
SOUHRN Chemie fluoralkylových činidel hypervalentního jódu dosáhla v posledních letech velkého uplatnění. Jak je nastíněno v úvodu práce, tyto sloučeniny jsou vysoce atraktivní jako potenciální léčiva, pokročilé materiály a agrochemikálie. Navzdory tomuto širokému využití fluoralkylových činidel hypervalentního jódu, jejich aplikace v biologických studiích není příliš rozvinutá. Cílem této práce je vývoj nových metod probíhajících za mírných podmínek a bez využití kovů, které by vedly k aplikaci v biologických studiích. V této práci byly prozkoumány dva druhy využití fluoralkylových činidel hypervalentního jódu pro značení biomolekul. První část práce se zabývá využitím již dříve zmíněných Togniho CF3 činidel a jejich tetrafluorethylových analogů při radikálových fluoralkylacích elektronově bohatých substrátů jako jsou deriváty indolu a pyrrolu s využitím askorbátu sodného jako redukčního činidla. Tato transformace poskytuje trifluormethylované a 1,1,2,2-tetrafluorethylované produkty ve středně dobrých až vysokých výtěžcích. Tato činidla byla také použita pro značení několika peptidů a proteinů obsahujících aromatické aminokyseliny. Pomocí výše zmíněné reakce byly tyto peptidy a proteiny obsahující elektronově bohaté aromatické řetězce jako Trp, Phe, Tyr a His fluoralkylovány s vysokou selektivitou vůči...
|
|
|
Enzymatic synthesis of DNA modified in the minor groove
Matyašovský, Ján ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Hlaváč, Jan (oponent) ; Urban, Milan (oponent)
Souhrn V první části práce byla navržena a syntetizována řada šesti modifikovaných 2'- deoxyadenosintrifosfátů, nesoucí malé funkční skupiny (chlor, amino, methyl, vinyl, ethynyl a fenyl) na adeninu v poloze 2. Připravené nukleotidy byly testovány jako substráty pro DNA polymerázy v enzymatické syntéze DNA modifikované v malém žlábku. 2-Fenyl modifikovaný dATP byl jediným trifosfátem, který nebyl inkorporovaný, což znamená, že fenylová skupina je již příliš velká pro inkorporaci do malého žlábku. Všechny ostatní testované nukleotidy byly dobrými substráty pro testované DNA polymerázy [KOD XL, Vent(exo-) a Bst LF], což poskytlo modifikovanou DNA s malým žlábkem nesoucím jednu nebo čtyři modifikace. Modifikované DNA s vinylovou nebo ethynylovou skupinou byly poté použity pro modifikaci malého žlábku DNA fluorescenčními značkami za použití click reakcí. Ethynylová skupina reagovala v mědí katalyzované cykloadici alkynu s azidem (CuAAC), zatímco vinylová skupina se účastnila thiol- en-ové reakce. Tento postup umožnil připojení velkých funkčních skupin, které by jinak nemohly být instalovány do malého žlábku DNA pomocí přímé enzymatické inkorporace. Druhá část práce byla věnována studiu 2-alkylamino-2'-deoxyadenosin trifosfátů a jejich použití v enzymatické syntéze modifikovaných oligonukleotidů a DNA. N2 -alkyl...
|
|
|
Synthesis and studies of modified DNA: (i) development of DNA targeting molecular scissors and (ii) competitive enzymatic incorporation of base-modified nucleotides
Panattoni, Alessandro ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Urban, Milan (oponent) ; Fojta, Miroslav (oponent)
Souhrn V první části této práce byla vyvinuta série specifických umělých metalonukleáz (AMN), které konjugují sevřené fenanthrolinové měděné komplexy (Clip-Phen) s oligonukleotidy vytvářejícími triplex (TFO). Pro syntézu hybridů TFO-AMN bylo zkoumáno několik syntetických cest, přičemž všechny sdílely mědí katalyzovanou alkyn-azidovou cykloadici (CuAAC) jako klíčový krok. V důsledku toho byly připraveny stavební bloky pro enzymatickou nebo chemickou syntézu oligonukleotidů (ON) obsahujících klikací skupiny nebo již konjugované s ligandem Clip-Phen přes CuAAC. Byly navrženy a vyvinuty dva nové alkynyl modifikované nukleosid-5'-O-trifosfáty (dNTP), aby bylo dosaženo účinné polymerázové inkorporace klikacích alkynyl řetězců do ON a zároveň zvýšení účinnosti CuAAC reakcí na modifikované DNA. Byly také připraveny odpovídající 3'-O- fosforamidity, aby se pomocí chemické syntézy na pevné fázi vložily stejné alkynylové linkery do ON. AMN byla připojena na 5'- nebo 3'- koncích nebo uprostřed TFO úseku pomocí různých linkerů. Byla studována hybridizace všech syntetizovaných TFO s duplexem DNA obsahujícím cílovou sekvenci. Nakonec byla provedena rozsáhlá studie účinnosti štěpení a specificity konjugátů TFO-AMN vůči cílové DNA, přičemž se zkoumal vliv vlastností hybridů a reakčních parametrů. Ve druhé části této práce...
|
|
|
New redox labels for DNA
Simonova, Anna ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Urban, Milan (oponent) ; Vyskočil, Vlastimil (oponent)
Cílem mé disertace byla syntéza modifikovaných 2'-deoxyribonukleosid trifosfátů (dNTP) nesoucích elektrochemicky oxidovatelné značky a jejich inkorporace do DNA pro aplikace v bioanalýze. V první části disertace jsem vyvinula syntézu modifikovaných dNTP nesoucích 2,3- dihydrobenzofuran (DHB) nebo 2-methoxyphenol (MOP) v poloze 5 u 2'-deoxycytidin-5'-O- trifosfátu a v poloze 7 u 7-deaza-2'-deoxyadenosin-5'-O-trifosfátu pomocí Suzukiho- Miyaurových cross-coupling reakcí. Poté byly modifikované dNTP využity jako substráty pro DNA polymerasy při enzymové syntéze modifikovaných DNA pomocí PCR nebo prodlužování primeru. Studovali jsme elektrochemické vlastnosti nukleosidů, dNTP a DNA značených DHB nebo MOP skupinami s použitím metod square-wave voltametrie (SWV) na pyrolytické grafitové elektrodě (PGE) a pozorovali signály oxidace MOP při cca. 0.5 V a oxidaci DHB při 0.85V. Využití DHB skupiny v kombinaci s dalšími redoxními značkami bylo limitováno blízkostí pozice jejího oxidačního píku k signálům přirozených nukleobází, zatímco MOP skupina byla úspěšně použita k redoxnímu kódování nukleobází v kombinaci s aminofenylovou nebo benzofurazanovou značkou, kdy každá značka poskytla odlišný a nezávisle detekovatelný redoxní signál. V druhé části disertace jsem studovala fenothiazin (PT) jako novou redoxní...
|
|
|
The physiological and proteomic characterisation of winter oilseed rape upon abiotic stress
Urban, Milan ; Vítámvás, Pavel (vedoucí práce) ; Hnilička, František (oponent) ; Valentová, Olga (oponent)
in Czech language, Ph.D. thesis - Milan Urban, 2017 V některých letech je zemědělská produkce brukve řepky olejky - významné plodiny České republiky - ohrožena (kromě biotických stresů) mrazem či suchem. V prvním přehledovém článku jsme proto věnovali pozornost proteinům, které byly nalezeny ve studiích porovnávajících genotypy s různou mírou tolerance k abiotickým stresům. V tomto článku jsme se také zaměřili na aplikaci výsledků proteomických studií ve šlechtitelských programech a při zvyšování odolnosti plodin ke stresům obecně. Vlastní výsledky jsme pozorovali u chladově aklimovaných, nejarovizovaných rostlin řepky ve fázi listové růžice. V druhém článku jsme prokázali signifikantní vztah mezi mrazuvzdorností, akumulací dehydrinů a aklimací fotosyntetického aparátu u pěti odrůd řepky. Při porovnání s dřívějšími výsledky jsme pozorovali nejen specifickou akumulaci dehydrinu D97, ale i kvalitativní změny dalších dehydrinů. Tyto výsledky naznačují, že úroveň získané mrazuvzdornosti je závislá nejen na aklimaci fotosyntézy, ale i na vyšší akumulaci ochranných složek. Stres sucha (článek č. 3) byl navozen ve fázi prodlužování stonku před kvetením, což je fáze, ve které rostlina musí přijmout větší množství vody. Pozdní jarní přísušky před nebo během kvetení výrazně snižují výnos a kvalitu produkce....
|
host ::
RSS.