|
|
Rekombinantní exprese receptoru imunoglobulinové rodiny NKp30
Tůmová, Lucie ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
NK buňky patří mezi lymfocyty přirozeného imunitního systému, které jsou schopné cytotoxicky usmrtit některé nádorové a viry infikované buňky, produkovat cytokiny a účastnit se tvorby adaptivní imunitní odpovědi. Tato bakalářská práce se zabývá lidským receptorem NK buněk, receptorem NKp30. Tento protein se řadí mezi aktivační receptory, které jsou schopny aktivovat cytotoxickou funkci NK buněk. Jeho trojrozměrná struktura a interakce mezi NKp30 a jeho fyziologickým ligandem B7-H6 byla nedávno rozřešena, nicméně interakce s jeho ostatními ligandy, BAT3 a pp65, vyřešena nebyla. Cílem práce bylo optimalizovat produkci extracelulární domény receptoru NKp30 v prokaryotickém expresním systému. Strukturní studie tohoto proteinu mohou poskytnout další detaily o interakci mezi receptorem NKp30 a jeho ligandy BAT3 a pp65.
|
|
|
Příprava expresního konstruktu receptoru NKp44
Hajná, Vladimíra ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Ptáčková, Renata (oponent)
NK buňky jsou součástí vrozeného imunitního systému. Jejich okamžitá reakce na patogen hraje roli hlavně při eliminaci nádorových či virem napadených buněk. V poslední době jsou NK buňky stále více předmětem různých studií, a to zejména různé formy jejich receptorů. Jednou skupinou receptorů NK buněk jsou receptory přirozené cytotoxicity (NCR), kam kromě dalších dvou členů patří také receptor NKp44. Receptory NCR hrají důležitou roli při aktivaci NK buněk. Receptor NKp44 je označován jako první receptor, který je specifický jen pro aktivované NK buňky. Ligandy receptoru NKp44 nejsou dosud zcela známé. Nedávný výzkum poukázal na jeden z možných ligandů, a to na protein PCNA, který překvapivě prostřednictvím tohoto receptoru působí inhibičně na funkce NK buňky. Cílem této práce bylo získat konstrukt kódující extracelulární část lidského receptoru NKp44. Byla provedena izolace RNA z buněčné linie NK-92MI, z níž byl následně pomocí PCR reakcí získán inzert DNA. Ten byl poté nejdříve ligován do klonovacího pBS vektoru a nakonec do produkčního pET vektoru. Ve výsledku byl tedy získán vektor pro expresi extracelulární části receptoru NKp44.
|
|
|
Vliv kovalentně vázané fluorescenční značky na strukturu a funkci proteinů
Petrovová, Gabriela ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
Fluorescenční značení je velmi často používanou metodou určenou k vizualizaci všech typů biomolekul včetně proteinů a proteinových komplexů. Dosud však nebylo zkoumáno, jakým způsobem a v jakém rozsahu toto značení ovlivňuje jejich strukturu a funkci. Tato diplomová práce se tedy zabývá vlivem vazby NHS-fluoresceinu na modelový protein lidské karbonát dehydratasy (hCA-I). Cílem této práce byla příprava rekombinantní 15N-hCA-I, studium její struktury pomocí NMR spektroskopie po značení fluoresceinem, studium ovlivnění relativní enzymové aktivity hCA-I v závislosti na míře fluorescenčního značení a v neposlední řadě také analýza produktů pomocí ESI FT-ICR MS vzniklých po vazbě karbonát dehydratasy NHS-fluoresceinem. Využitím těchto metod byly stanoveny obecné experimentální podmínky pro použití fluorescenčního značení s minimálním efektem na strukturu proteinu a jeho funkci. Z výsledků této práce vyplývá, že při výpočtech molárních nadbytků přidávaného NHS-fluoresceinu k proteinům nelze použít dosavadního jednoduchého postupu, ale je více než nutné zohlednit vliv relativní enzymové aktivity proteinu, která klesá se zvyšujícím se molárním nadbytkem fluorescenční značky, a že výpočet molárních nadbytků neodpovídá skutečnému stupni značení. V budoucím výzkumu bude nutné provést optimalizaci pro další...
|
|
|
Studium struktury receptoru DCL-1 pomocí hmotnostní spektrometrie
Růžičková, Barbora ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Mrázek, Hynek (oponent)
DCL-1 (CD302) je transmembránový C-lektinový receptor typu I, který je exprimován na monocytech, makrofázích, granulocytech a dendritických buňkách. Jeho extracelulární doména však postrádá aminokyselinové motivy, esenciální pro vazbu sacharidových struktur v přítomnosti vápenatých kationtů, což naznačuje, že nemá klasickou vazebnou aktivitu typickou pro C-lektinové receptory jako například manosový receptor. Žádné jeho exogenní nebo endogenní ligandy ovšem nebyly dosud nalezeny. V důsledku vnitřní kolokalizace s F-aktinem lze předpokládat, že tento nekonvenční lektinový receptor hraje důležitou roli nejen v endocytóze a fagocytóze, ale také v buněčné adhezi a migraci. Receptor DCL-1 byl poprvé identifikován jako genetický fúzní partner lidského multilektinového receptoru DEC-205 v buněčné linii Hodgkinova lymfomu. Experimentální část této práce se zabývá identifikací zapojení disulfidických vazeb a získání dat k validaci krystalové struktury DCL-1. Nejprve byla provedena optimalizace podmínek produkce a renaturace za účelem získat co největší množství proteinu DCL-1, resp. jeho extracelulární domény. Optimální podmínky byly využity k přípravě proteinu, se kterým bylo provedeno štěpení v gelu specifickými endopeptidasami za přítomnosti cystaminu následované LC-MS analýzou. Porovnáním naměřených dat z LC-MS...
|
|
|
Exprese a purifikace N-koncové části filamentózního hemaglutininu z Bordetella Pertussis v E. Coli
Jurnečka, David ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
: Černý kašel je vysoce nakažlivé onemocnění způsobené gramnegativní bakterií Bordetella pertussis. V průběhu infekce bakterie produkuje celou řadu toxinů a adhezivních molekul, mezi něž patří i filamentózní hemaglutinin (FHA). FHA je 220 kDa povrchový protein, jenž je také produkován ve velkém množství do média, a hraje klíčovou úlohu v interakci mezi bakterií a hostitelskými buňkami. Cílem této práce bylo vytvořit heterologní expresní systém na produkci N-koncové části B. pertussis FHA (FHA1-862) v buňkách Escherichia coli. Pro sekreci proteinu FHA1-862 do media byl vytvořen plasmid skládající se ze systému dvou nezávislých T7/Lac promotorů, první pro gen fhaB kódující FHA1-862, a druhý pro gen fhaC kódující transportní protein, jenž umožňuje přenos FHA z periplasmatického prostoru do extracelulárního média. Protein byl úspěšně sekretován v buňkách E. coli BL21 nesoucí plasmid pMM100 (LacIq ) při 30 řC a přečištěn pomocí afinitní kapalinové chromatografie na nosiči Cellufine. Tyto výsledky naznačují, že protein FHA862 může být produkován expresním systémem E. coli, nicméně tento systém poskytuje malou výtěžnost proteinu.
|
|
|
Rekombinantní produkce bovinních NK receptorů
Böerová, Nikola ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
NK buňky, které jsou součástí vrozeného imunitního systému, získávají stále větší pozornost, zejména kvůli svým schopnosti cytotoxicky zabíjet buňky některých nádorových linií a při určitých virových, bakteriálních či parazitárních napadeních organismu. NK buňky byly objeveny již v 70. letech 20. století a hrají důležitou roli při orgánových transplantacích, v boji s HIV a s jinými autoimunitními onemocněními. S okolím komunikují prostřednictvím svých receptorů, které zejména rozpoznávají nedostatečnou expresi MHC I glykoproteinů na povrchu cílových buněk, čímž se buňky brání rozpoznání cytotoxickými lymfocyty. Dodnes u některých z těchto receptorů nebyla rozřešena prostorová struktura, fyziologický ligand či jejich přesná role v organismu. Tato diplomová práce se zabývá výzkumem receptorů pocházejících z tura domácího (Bos taurus), který nepatří mezi klasická laboratorní zvířata a mým úkolem bylo přispět do výzkumu této skupiny proteinů. Zabývala jsem se jedněmi z nejdůležitějších zástupců NK receptorů a to CD69, NKRP1 a NKG2D získaných rekombinantní produkcí v bakteriálních buňkách. Výsledky publikované v této diplomové práci navazují na mou bakalářskou práci a společně tak mohou být přínosem pro další strukturní výzkum proteinů a tím v budoucnu mohou pomoci např. ve veterinární medicíně.
|
|
|
Studium receptoru dendritickych bunek DCL-1 pomocí technik NMR
Pospíšilová, Eliška ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Schneider, Bohdan (oponent)
(ČJ) Receptor DCL-1 (CD302) vyskytující se především na povrchu dendritických buněk je na základě sekvenční podobnosti zařazen do rodiny C-lektinových receptorů. Jelikož však jeho extracelulární doména postrádá jakékoli motivy pro vazbu sacharidových struktur v koordinaci s kationtem vápníku, lze předpokládat, že pokud bude sacharidové struktury vázat, nebude se tak dít klasickou cestou jako například u manosového receptoru nebo receptoru DEC-205. V rámci kolokalizace DCL-1 s F-aktinem se nabízí předpoklad, že hraje určitou roli v buněčné adhezi a migraci. Další předpokládanou funkcí DCL-1 je receptorem zprostředkovaná endocytóza a následné směrování do lysozomů. V posledních letech byl tento receptor také spojován s rozličnými patologickými stavy. Experimentální část této práce lze rozdělit do tří úrovní. V první fázi proběhla produkce proteinového konstruktu založeného na extracelulární doméně DCL-1 v M9 minimálním médiu, kde byl přítomen jako jediný zdroj dusíku 15 NH4Cl a jediný zdroj uhlíku 13 C glukóza. Tímto byl získán 15 N a 13 C značený protein, který byl použit pro NMR měření. Druhá část práce se zabývá vyhodnocením NMR spekter, která umožnila přiřazení frekvencí atomům peptidové páteře i alifatických postranních řetězců aminokyselin. Na základě informace o chemických posunech jader...
|
|
|
Sulfatované metabolity silybinu a jejich interakce se sulfatasami
Ježková, Zuzana ; Weignerová, Lenka (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Bakalářská práce řeší problematiku syntetických sulfatovaných metabolitů silybinu při jejich interakcích se sulfatasami. Silybin je flavonolignan izolovaný ze semen ostropestřce mariánského (Silybum marianum). Sulfáty silybinu (metabolity) nebyly z organismu dosud izolovány a jejich struktura nebyla tudíž přesně určena. V této práci je uveden postup přípravy silybin-7,23-disulfátu, který byl syntetizován z přírodního silybinu. Disulfát silybinu byl izolován a spektrálně charakterizován (NMR, MS). Dále byly změřeny kinetické parametry reakce pNPS se sulfatasou z Helix pomatia: Km = 0,0494 mmol/l a Vmax = 0,0325 mmol/dm3 /min. Podmínky pro práci se sulfatasou z Helix pomatia byly zvoleny v souladu s literaturou. Jedním z hlavních cílů této práce bylo zjistit zda silybin-7,23-disulfát je substrátem či inhibitorem sulfatasy z Helix pomatia. Měřením aktivity sulfatasy z Helix pomatia v přítomnosti různých koncentrací silybin-7,23-disulfátu bylo zjištěno, že disulfát silybinu při koncentraci vyšší než 0,2 mM je silným inhibitorem testované sulfatasy. Dále bylo provedeno několik reakcí kde silybin-7,23-disulfát byl použit ve vhodné koncentraci jako potenciální substrát pro sulfatasu z Helix pomatia. Reakce byly monitorovány metodou HPLC a bylo prokázáno, že sulfatasa z Helix pomatia štěpí...
|
|
|
Studies of NK cell receptors and other proteins using recombinant expressions and mass spectrometry
Kavan, Daniel
Receptor CD69 je považován za marker aktivovaných lymfocytů a je exprimován na všech místech aktivní imunologické odpov diě . Fyziologicky se vyskytuje jako disulfidicky vázaný homodimer, ovšem z modelu je patrné, že k dimerizaci krom disulfidického m stku značnou mírou p ispívá také kontaktě ů ř Q93 jedné a D88 spolu s E87 na druhé podjednotce a ješt výrazn jiě ě R134 jedné a A136 a Y135 druhé. Na základ tohoto pozorování byly Q93, R134 nebo oboje mutoványě na alaniny a následn ukázáno, že jako monomer se chovala jen dvojnásobn zmutovanáě ě forma. Tato skutečnost m la také významný vliv na vazbu sacharidových ligand , neboě ů ť monomerní forma vykazovala výrazn nižší afinitu ke GlcNAcu (ě Kd ádov 10ř ě -5 M), než forma dimerní (Kd ádov 10ř ě -6 M) nebo dokonce delší kovalentn dimerní konstruktyě (Kd ář dov 10ě -7 M). Oproti pozorovanému kratšímu času eluce z gelov filtrační kolonyě po vysycení receptoru ligandem (GlcNAc), který by mohl naznačovat zm nu struktury,ě však experimenty v analytické ultracentrifuze neukázaly žádnou zm nu sedimentačníhoě koeficientu, podobn ani porovnání nam ených HSQC NMR spekter p ed a po vysyceníě ěř ř ligandem neodhalily žádné výrazné zm ny.ě Vodíko-deuteriová vým na je chemický d j, p i kterém je kovalentně ě ř ě vázaný atom vodíku vym n n za deuterium, nebo...
|
|
|
Studies of NK cell receptors and other proteins using recombinant expression and mass spectrometry
Kavan, Daniel ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Tučková, Ludmila (oponent) ; Řehulka, Pavel (oponent)
Univerzita Karlova v Praze P írodov decká fakultař ě Katedra biochemie Studium receptor NK bun k a jinýchů ě protein pomocí rekombinantní expreseů a hmotnostní spektrometrie Autoreferát dizertační práce Daniel Kavan Školitel: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. Praha 2010 Daniel Kavan Úvod Úvod NK bu ky a jeden z jejich receptor CD69ň ů P irození zabiječi (NK bu ky) jsou subpopulacíř ň velkých granulárních lymfocyt , kterým na bun čnémů ě povrchu schází receptory charakteristické pro B a T bu ky.ň Jsou nicmén charakterizovány p ítomností NKp46 a NKp30ě ř [Moretta L. et. al. 2002]. Pojmenování bun k p irozeníě ř zabiječi vzniklo podle funkce v organismu, protože nepot ebují žádnou p edchozí aktivaci a p esto jsou schopnyř ř ř eliminovat nenormální (tedy infikované nebo transformované) bu ky z tkánň ě [Kiessling R. et. al. 1975]. Tato funkčnost je založena na kontrole MHC molekul I. T ídyř okolních bun k. Výsledná akce (zničení nebo nezničeníě cílové bu ky) je výsledkem rovnováhy aktivačních aň inhibičních signál zprost edkovanými povrchovýmiů ř receptory a p evedenými na konkrétní signální dráhyř [Raulet D. H. et. al. 2001]. Specifita NK bun k není závislá na jediném druhuě receptoru, jako je tomu u B a T bun k, ale je dánaě r znorodostí jejich povrchových receptor [Lanier L. L.ů ů 2005]. Tyto receptory pak...
|
host ::
RSS.