|
|
Kvasinky při studiu neurodegenerativních chorob
Motyčková, Věra ; Schierová, Michaela (vedoucí práce) ; Zikánová, Blanka (oponent)
Kvasinky jsou tradiční modelové organismy, které však lze - možná trochu překvapivě - využít i při studiu neurodegenerativních chorob, např. Parkinsonovy choroby, Alzheimerovy choroby nebo Huntingtonovy choroby. Těmito neurodegenerativními chorobami trpí především starší lidé, protože ve stáří dochází k úbytku kontrolních mechanismů v buňkách, což má na organismus patologický efekt. Spojujícím faktorem těchto onemocnění jsou příčiny patologické změny na buněčné úrovni, narušen je vezikulární transport, syntéza a degradace proteinů, v buňkách se zvyšuje oxidativní stres a produkce ROS. Hlavní příčinou těchto chorob je špatné skládání proteinů, které způsobuje tvorbu cytotoxických proteinových shluků. Byly připraveny kvasinkové kmeny, pomocí nichž je možné identifikovat geny a proteiny, které ovlivňují toxicitu těchto klíčových proteinů. Pokud tyto geny mají lidské orthology, jsou potenciálními terapeutickými cíly. Cílem této práce je shrnout metody studia příčin onemocnění na buněčné úrovni a hlavní výsledky výzkumu v kvasinkových modelech. Klíčová slova: kvasinky, modelový organismus, Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba, Huntingtonova chorea
|
|
|
Protein synthesis in cellular stress
Cienciala, Martin ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Holá, Dana (oponent)
Mnoho organizmů z různých větví života se často potýká s buněčným stresem zapříčiněným podmíkami vnějšího prostředí. Pro boj s těmito nepříznivými podmínkami se vyvinulo mnoho komplexních mechanismů. Kvasinka Saccharomyces cerevisiae je obzvláště dobře vybavená pro eliminaci negativních účinků oxidativního nebo osmotického stresu. Tyto podmínky zpravidla vedou k zastavení produkce proteinů. Kináza GCN2 se považuje za hlavního zprostředkovatele této odpovědi. Zastavení produkce proteinů je také doprovázeno vyšší expresí proteinů, podílejících se na boji se stresem. Tvorbě těchto proteinů předchází sada specializovaných regulačních procesů, fungujících na různých stupních proteinové exprese. Tato práce se pokusí přednést rozmanitost a komplexitu jednotlivých úrovní této regulace.
|
|
|
Analýza zotavování membránového potenciálu kvasinek za stresových podmínek vyvolaných protonoforem CCCP
Babuka, David ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Sigler, Karel (oponent)
Diplomová práce se zabývá studiem odezvy vnitrobuněčného pH kvasinkových buněk na různá vnější prostředí, především ve vztahu k protonoforu karbonylkyanidu m-chlorophenylhydrazonu, CCCP. K měření vnitrobuněčného pH kvasinkových buněk jsme využívali geneticky kódovanou fluorescenční sondu poměrový pHluorin. S využitím metody synchronně skenovaných fluorescenčních spekter jsme byli schopni měřit vnitrobuněčné pH buněk s vysokou přesností. Jako součást těchto experimentů jsme studovali také jak vliv iontové síly pufrů buněčných suspenzí na povrchový potenciál kvasinek, tak vliv anorganické soli KCl na depolarizaci membrán kvasinek a acidifikaci cytosolu vyvolanou protonoforem CCCP. Zkoumali jsme jednak přímo změny cytosolického pH a jednak jsme toto naměřené pH používali jako indikátor procesů a stavu prostředí mimo buňku. K nejvýznamnějším výsledkům této práce patří vyvinutí nové metody monitorování velikosti povrchového potenciálu kvasinek pomocí titračních křivek acidifikace cytosolu vyvolané protonoforem CCCP.
|
|
|
Deconvolution fluorescence microscopy of yeast cells
Štec, Tomáš ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent)
Název práce: Využití dekonvoluce v digitální fluorescenční mikroskopii kvasinek Autor: Tomáš Štec Katedra/ústav: Fyzikální ústav Univerzity Karlovy Vedoucí diplomové práce: prof. RNDr. Jarmoír Plášek, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: Fluorescenční mikroskopie představuje rychlou a levnou alternativu k po- kročilejším metodám zobrazování jako jsou konfokální a elektronová mikroskopie. Snímaný obraz je však zatížen velkou mírou zkreslení. Pomocí počítačového zpraco- vání obrazu - dekonvoluce, lze do značné míry eliminovat zkreslení obrazu, čím se umožní rekonstrukce třírozměrné podoby snímaných objektů. V této práci je pod- robně prozkoumána dekonvoluční procedura programu NIS Elements AR, která je následně aplikována na rekonstrukci třírozměrné podoby kvasinek Saccharomyces cerevisiae barvených calcofluorem, s cílem charakterizovat změny vzhledu bunkové stěny v průběhu stárnutí. S rostoucím věkem kvasinky se na povrchu objevují ne- rovnosti, ke konci života dochází i k praskání bunkové stěny. Klíčová slova: fluorescence, mikroskopie, dekonvoluce, NIS Elements AR, calcof- luor, kvasinky, bunková stěna, stárnutí
|
|
|
Extracelulární matrix u kvasinkových populací
Novotná, Pavla ; Kuthan, Martin (vedoucí práce) ; Dvořáček, Lukáš (oponent)
Mikroorganismy se v přírodním prostředí nejčastěji vyskytují v mnohobuněčných formách, nejčastěji v biofilmech. Biofilm je charakterizován jako společenství buněk, žijících na rozhraní prostředí, uzavřených v extracelulární matrix. ECM tvoří významnou složku biofilmů u kvasinkových populací. Extracelulární matrix funguje jako ochranná bariéra a umožňuje buňkám přežívat v nepříznivých podmínkách i lépe kompetovat o prostředí s ostatními mikroorganismy. Tvoří také účinnou bariéru proti antibiotikům či jiným škodlivým látkám, což dělá z biofilmů velký problém ve zdravotnictví a průmyslu. Tvorba matrix může být ovlivněná morfologickými formami kolonií. U některých mikroorganismů dochází ke zvýšené tvorbě ECM při fenotypovém přepínání jako reakce na změnu životních podmínek. Složení ECM je rodově i druhově specifické. Hlavní složku matrix tvoří polysacharidy a proteiny.
|
|
|
GAL4/UAS binární systém jako nástroj pro studium genové funkce
Soukup, Tomáš ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
GAL4/UAS systém je bipartitním nástrojem genového inženýrství, umožňujícím ektopickou expresi in vivo v časovém i tkáňově specifickém kontextu. Design této techniky vychází z mechanismů regulace genové transkripce, objasněných z veliké části experimentálním studiem regulace metabolického okruhu pro zpracování galaktosy organismu Saccharomyces cerevisiae. Nezávislou inkorporací genu pro transkripční faktor Gal4p a jeho vazebné sekvence (UAS) za pomoci transposibilních technik a technik pro integraci do specifické části genomu je možné generovat stovky stabilních, transgenních linií. Křížením jedince z GAL4 linie s jedincem z UAS linie lze následně získat jedince, vykazujícího za vhodných, regulovatelných podmínek ektopickou expresi. Tato práce představuje syntézu základních principů GAL4/UAS systému a jeho variant, adaptovaných zejména pro potřeby genových manipulací s modelovými organismy Drosophila melanogaster a Danio rerio. Dále tento text shrnuje propojení GAL4/UAS systému s dalšími technikami a ve stručnosti poukazuje na možnosti praktické aplikace zejména na poli neurologie. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Změny vnitrobuněčného pH kvasinek za stresových podmínek
Divín, Radek ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Název práce: Změny vnitrobuněčného pH kvasinek za stresových podmínek Autor: Radek Divín Katedra / Ústav: Fyzikální ústav Univerzity Karlovy Vedoucí diplomové práce: prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc. Abstrakt: Specifické hodnoty intracelulárního pH (pHi) mohou ovlivnit veškeré biochemické procesy v buňce, což je důvodem důležitosti studia změn intracelulárního pH za stresových podmínek. V práci bylo využito kvasinek Saccharomyces cerevisiae jakožto modelového organismu eukaryotních buněk. Monitorování intracelulárního pH buněk bylo prováděno metodou sychronního skenování fluorescence geneticky kódované fluorescenční sondy pHluorin, lokallizované v cytosolu buněk. Buňky byly vystaveny stresovým podmínkam vlivem chemických změn prostředí. Studovala se schopnost buněk udržet si stálou hodnotu intracelulárního pH v různě kyselých prostředích. Pozornost se věnovala také vlivu glukózy na optimalizování cytosolického pH. Práce se zabývá i změnami intracelulárního pH pod vlivem přítomnosti KCl v suspenzi. Dále se monitoroval pokles cytosolického pH buněk působením protonoforu CCCP. Vliv stresového prostředí na intracelulární pH byl studován z pohledu variací chemických látek a jejich množství v buněčné suspenzi a dále i z pohledu růstové fáze zkomaných buněk. Klíčová slova: Saccharomyces cerevisce, vnitrobuněčné pH,...
|
|
|
Role Sch9p a Rim15p signálních drah při vývoji kolonií kvasinek
Mikešová, Jana ; Palková, Zdena (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
Laboratorní kmen kvasinky Saccharomyces cerevisiae BY4742 vytváří na pevném médiu kolonie, které jsou horizontálně a vertikálně diferencované. Vertikálně diferencovanou centrální část kolonie tvoří dvě morfologicky i fyziologicky odlišné populace buněk, které jsou výrazně oddělené. V horní části kolonie se vyskytují takzvané U buňky, v dolních částech se nachází takzvané L buňky. Molekulární mechanismy vertikální diferenciace jsou z velké části neznámé. Hlavním cílem této práce bylo analyzovat, zda a jak změněná hladina vybraných proteinů signálních drah monitorujících dostupnost živin ovlivňuje vývoj a diferenciaci kvasinkových kolonií a především přežívání jejich U a L subpopulací. Zaměřila jsem se na kinázy Sch9p a Rim15p s centrálním postavením v signalizaci, transkripční aktivátory stresové odpovědi Msn2p a Msn4p a transkripční faktor Gis1p, který je důležitý pro přechod na respirační metabolismus. Mikroskopie tenkých řezů kolonií odhalila změnu ve vertikální diferenciaci kolonií kmene rim15Δ a částečně PTEF-SCH9 a změněnou morfologii U a L buněk kolonií ostatních analyzovaných kmenů. Změněná hladina Sch9p, Rim15p, Msn2/4p a Gis1p výrazně ovlivnila schopnost přežívání U i L buněk v čase. Morfologické a fyziologické změny vyvolané změnami hladin zmíněných proteinů poukazují na fakt, že rozdílná...
|
|
|
Využití protilátek k charakterizaci chromatinových modifikací u Saccharomyces cerevisiae
Kovaľová, Libuša ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Malík, Radek (oponent)
Transkripce prekurzorové mRNA (pre-mRNA) a její sestřih byly donedávna vnímány jako dva na sobě nezávislé procesy. Na modelu Saccharomyces cerevisiae bylo ukázáno, že sestavovaní komplexu katalyzujícího sestřih pre-mRNA, spliceosomu, probíhá kotranskripčně, tedy v době před ukončením transkripce RNA polymerasou II. Studiem kotranskripčního sestřihu se zjistilo, že proteiny účastnící se transkripce a specifické chromatinové modifikace mohou ovlivňovat sestřih pre-mRNA a jeho regulaci. Uvažuje se rovněž, že sestavování spliceosomu a modifikace chromatinu se vzájemně ovlivňují. Protein Prp45, kvasinkový ortholog lidského transkripčního koregulátoru SKIP/SNW1, byl v literatuře dosud spojován pouze se sestřihem. Nepublikované výsledky získané v naší laboratoři naznačují, že by Prp45 mohl sloužit jako regulátor spřahující procesy transkripce a sestřihu. Ukázali jsme, že PRP45 geneticky interaguje s faktory důležitými pro elongaci transkripce, mimo to i s enzymy katalyzujícími chromatinové modifikace, a že protein Prp45 ovlivňuje sestavování spliceosomu v časné fázi sestřihu pre-mRNA. Cílem bakalářského projektu bylo pomocí metody chromatinové imunoprecipitace sledovat propojení fyziologické role proteinu Prp45 a trimethylace H3K4. Bylo zjištěno, že mutace prp45(1-169) výrazně neovlivňuje profil...
|
|
|
Fyziologické úlohy Na+/H+ antiporterů v kvasinkách
Zahrádka, Jaromír ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Pichová, Iva (oponent)
3 Abstrakt Kvasinky Saccharomyces cerevisiae patří k důležitým modelům při studiu homeostase iontů alkalických kovů. Stejně jako v jiných buňkách je pro S. cerevisiae nezbytné udržení určité koncentrace K+ uvnitř buněk, na druhou stranu Na+ a další ionty alkalických kovů jsou pro buňky toxické. K+ je akumulován pomocí uniporterů Trk1 a Trk2, zatímco export toxických iontů alkalických kovů, a také nadbytečného K+ , je zajištěn ATPasami Ena, Na+ (K+ )/H+ antiporterem Nha1 a K+ selektivním kanálem Tok1. Ačkoli jsou jednotlivé transportery poměrně dobře prozkoumány, není dosud mnoho známo o celkové regulaci homeostase iontů alkalických kovů ani o vzájemné interakci a regulaci mezi jednotlivými transportery. V rámci této práce byl studován antiporter Nha1 a jeho fyziologické úlohy v kontextu ostatních transporterů iontů alkalických kovů. Ukázalo se, že nejen Nha1p, ale také další exportery, ATPasy Ena a kanál Tok1, jsou, přes jejich výraznou odlišnost v mechanismu transportu i způsobu regulace, regulovány společně změnou aktivity importerů K+ a to prostřednictví membránového potenciálu. Vzájemná regulace a funkční propojení importerů a exporterů K+ , ale také další výsledky poprvé ukázaly, jak velice důležitá je neustálá cirkulace K+ , tedy současný vstup a výstup K+ , pro udržování homeostase iontů alkalických...
|
host ::
RSS.