|
|
Non-template activities of DNA/RNA polymerases and their significance
Pokorná, Kristýna ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Pospíšil, Jiří (oponent)
Netemplátové přidávání adenosinu na 3' konec produktu u některých DNA polymeráz často využívaných v molekulární biologii je dosud neobjasněný fenomén, se kterým se potýkáme již několik desetiletí. Existuje jen málo jiných příležitostí, při kterých dochází k netemplátovému přidávání adenosinu na 3' konec informační molekuly v buňce, a jednou z nich je právě polyadenylace. Zároveň je známo, že určité RNA viry vykazují podobné aktivity v rámci polyadenylace či ko-transkripční modifikace svých mRNA. Tato práce se zaměřuje na detaily těchto tří procesů, na vztahy mezi nimi a dochází k závěru, že jsou všechny odvozeny ze stejné konzervované vlastnosti ancestrální polymerázy. Klíčová slova: DNA polymeráza, RNA polymeráza, netemplátová syntéza, Taq polymeráza, polyadenylace
|
|
|
Structural characterization of influenza A polymerase PA subunit domains in complex with novel inhibitors
Radilová, Kateřina ; Kožíšek, Milan (vedoucí práce) ; Rumlová, Michaela (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
RNA-dependentní RNA polymerasa viru chřipky je heterotrimerický komplex, který má zásadní roli v životním cyklu viru. Je zodpovědná za virovou replikaci a transkripci. Jedna z jejích podjednotek, PA podjednotka, interaguje s PB1 podjednotkou prostřednictvím důležité protein-proteinové interakce na své C-koncové doméně. Tato interakce, která je zprostředkovaná 310 helixem, je nutná k utvoření celého heterotrimerického komplexu. N-koncová doména navíc obsahuje místo s endonukleasovou aktivitou se dvěma manganatými ionty. Obě tyto domény jsou považovány za slibné terapeutické cíle. V současnosti jsou přístupy v léčbě a prevenci chřipkového onemocnění limitované na sezónní očkování a existuje pouze několik léků, které ve velké většině cílí na jiné proteiny viru chřipky. U řady z nich však dochází k rychlému vývoji rezistentních mutací, nebo mají závažné vedlejší účinky. Tato práce nabízí strukturní náhledy na dvě domény PA podjednotky. První část se věnuje charakterizaci a optimalizaci minimálního peptidu odvozeného z PB1 podjednotky, který interaguje s C-koncovou doménou PA podjednotky a brání jejich dimerisaci. Výsledky z této části mohou být považovány za počáteční bod pro racionální vývoj prvních inhibitorů PA-PB1 protein-proteinové interakce proti viru chřipky. V druhé polovině jsme zkoumali...
|
|
|
The omega subunit of Bacillus subtilis RNA polymerase.
Mikesková, Klára ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent)
Transkripce je zprostředkována enzymem RNA polymerázou (RNAP). RNAP obsahuje jádro tvořené dvěma podjednotkami α, a po jedné β, β' a ω. Tyto podjednotky jsou konzervované u všech bakterií. Podjednotka ω je malá podjednotka o velikosti 7,6 kDa, která se váže na podjednotku β'. Podjednotka ω je důležitá pro složení a integritu RNAP a výběr promotorů. Toto bylo ukázáno experimenty provedenými na Gram-negativních bakteriích, ale vědomosti o podjednotce ω u Gram-pozitivních bakterií jsou minimální. Ve své diplomové práci jsem charakterizovala ω z modelové Gram-pozitivní bakterie ze skupiny Firmicutes, Bacillus subtilis. Nejprve jsem připravila několik expresních kmenů pro izolaci podjednotky ω z Bacillus subtilis. Následně jsem úspěšně provedla její izolaci, což byl hlavní a původní cíl této Diplomové práce. Dále jsem testovala vliv podjednotky ω na transkripci in vitro pomocí asociace RNAP s primárním faktorem A i s alternativními faktory σF a σE , které regulují sporulaci u Bacillus subtilis. Také jsem studovala vliv podjednotky δ, malé podjednotky RNAP nacházející se u skupiny Firmicutes, a to samostatně, i v kombinaci s podjednotkou ω. Mé výsledky odhalily, že podjednotka ω stimuluje transkripci z promotorů vegetativních i těch asociovaných se sporulací. Navíc, tato stimulace byla synergicky...
|
|
|
Delta podjednotka RNA polymerázy u Grampozitivních bakterií
Matějčková, Jitka ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Beranová, Jana (oponent)
1 Abstrakt Aby bakteriální buňka přežila neustále se měnící podmínky, musí se na ně adaptovat. Tato adaptace je podmíněna změnou genové exprese. Klíčovým krokem genové exprese je transkripce. Hlavním enzymem bakteriální transkripce je RNA polymerasa (RNAP), což je esenciální vícepodjednotkový enzym. RNAP je nejvíce prostudována u Escherichia coli, modelového organismu gram negativních bakterií. Porovnala jsem E. coli a Bacillus subtilis (zástupce gram pozitivních bakterií) a shrnula jsem rozdíly v RNAP a transkripci. Jejich RNA polymerasy se liší přítomností podjednotky δ u gram pozitivních bakterií. Tato podjednotka zvyšuje promotorovou selektivitu, recykluje jádro RNAP a celkově stimuluje syntézu RNA. Podjednotka δ ovlivňuje sporulaci a virulenci některých bakterií. V této práci jsem shromáždila současné poznatky o jednotlivých částech genové exprese, zejména o regulaci iniciace transkripce a o podjednotce δ RNAP.
|
|
|
Factors interacting with bacterial RNA polymerase and their effect on the regulation of transcription initiation
Ramaniuk, Volha ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
(ČESKÝ) Bakteriální buňka reguluje svou genovou expresi jako odpověď na změny růstových podmínek. RNA polymeráza (RNAP) je stěžejním enzymem pro tento proces, její aktivita je ovlivňována mnoha transkripčními faktory. Ve své práci se zabývám faktory, které se účastní regulace transkripce u grampozitivních baktérií: faktory σ, iniciačními nukleozid trifosfáty (iNTP), HelD, δ a malou RNA Ms1. Hlavní důraz v této práci je kladen na faktory σ z Bacillus subtilis. Faktory σ rozpoznávají specifickou sekvenci DNA promotoru a umožnují navázaní RNAP na tuto sekvenci. Ve svém prvním projektu jsem vytvořila transkripční systém in vitro s purifikovanými alternativními σ faktory z B. subtilis - σB , σD , σH , σI . Pomocí tohoto systému jsem zkoumala efekt změny koncentrace iNTP ([iNTP]) na iniciaci transkripce. Prokázala jsem, že promotory přepisované pomocí alternativních σ faktorů jsou často regulovány [iNTP]. V dalším projektu jsem charakterizovala jeden z nejméně prozkoumaných alternativních faktorů z B. subtilis, I . Identifikovala jsem ~130 genů ovlivněných I , přitom 16 z nich bylo přepisováno přímoI . Prokázala jsem, že se I účastní metabolizmu železa v buňce, a že se váže nejenom na klasické sekvence -35 a -10, ale také na "prodloužené" -35 a -10 elementy. Ve spolupráci s bioinformatickou...
|
|
| |
|
|
Bakteriální RNA polymeráza a molekuly ovlivňující její funkci
Jirát Matějčková, Jitka ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Staněk, David (oponent)
RNA polymeráza (RNAP) přepisuje DNA do RNA a je jediným takovým enzymem provádějící transkripci u bakterií. Tento klíčový enzym rozhoduje o odpovědi buňky na vnější i vnitřní signály, rozhoduje o míře transkripce jednotlivých genů a tím reguluje genovou expresi. RNAP ovlivňují nejen vlastní podjednotky, ale i proteinové faktory, malé molekuly či malé RNA (sRNA). Cílem této disertační práce bylo přispět k poznání regulace RNAP a doplnit tak chybějící střípky do tohoto rozsáhlého tématu. Tato práce se zabývá vlivem vybraných proteinů (δ, YdeB, GreA) na citlivost RNAP vůči koncentraci iniciačního nukleosid trifosfátu ([iNTP]) při iniciaci transkripce u Bacillus subtilis. Ukázali jsme, že δ zvyšuje citlivost RNAP k [iNTP] na [iNTP]-senzitivních promotorech, nikoliv však u [iNTP]-nesenzitivních promotorů in vitro ani in vivo. Podjednotka δ je zásadní při soutěži o přežití, neboť umožňuje buňce okamžitě zareagovat na změnu podmínek. Protein YdeB se neváže na RNAP v B. subtilis a zároveň neprokázal žádný viditelný efekt na transkripci in vitro. Zjistili jsme tedy, že proteiny GreA a YdeB na rozdíl od podjednotky δ nejsou schopny ovlivnit citlivost RNAP k [iNTP] u [iNTP]-senzitivních promotorů in vitro. Charakterizovali jsme nově objevenou sRNA u Mycobacterium smegmatis - Ms1, silně produkovanou ve...
|
|
| |
|
|
RNA polymerase: The "meeting point" of regulatory networks
Wiedermannová, Jana ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Bakteriální RNA polymeráza (RNAP) je proteinový komplex nepostradatelný pro přepis DNA do RNA. Jakožto klíčový enzym zodpovědný za regulaci genové exprese shromažďuje signály z buňky a reaguje na ně přesným nastavením úrovně transkripce jednotlivých genů. Tento proces ovlivňují jak vlastní podjednotky RNAP tak i další transkripční faktory (TF), které přímo nebo nepřímo interagují s RNAP. Cílem této disertace bylo prohloubit znalosti o komplexitě transkripční regulační sítě a o provázanosti jejích jednotlivých nitek, které jsou stále objevovány. Hlavním tématem této PhD práce je protein HelD, nově objevený vazebný partner RNAP z bakterie Bacillus subtilis. Ukázali jsme, že HelD se váže mezi sekundární kanál RNA polymerázy a alfa podjednotky tohoto enzymu. HelD se váže na RNAP ve formě jádra (bez přítomnosti sigma faktoru). Dokázali jsme, že HelD stimuluje transkripci v závislosti na ATP tím, že napomáhá jejímu cyklování a elongaci. Stimulační efekt proteinu HelD je násoben působením podjednotky delta, malé podjednotky RNA polymerázy specifické pro gram positivní (G+) bakterie. Tento fakt odhalil nové vztahy v provázanosti komplikované transkripční sítě. Další dvě publikace této práce pojednávají o vlastní delta podjednotce. Pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) jsme vyřešili 3D strukturu a...
|
|
|
Regulation of transcription in mycobacteria.
Páleníková, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Mrvová, Silvia (oponent)
Bakteriálna bunka sa musí vedieť rýchlo prispôsobiť zmenám, ktorým je vystavená v prostredí. Na tieto zmeny reaguje reguláciou génovej expresie primárne na úrovni iniciácie transkripcie. Medzi formy reguláciu transkripcie môžeme zaradiť rôznu stavbu promótorových oblastí pred odlišnými skupinami génov, prítomnosť alternatívnych sigma faktorov a tiež ovplyvňovanie priebehu génovej expresie pôsobením transkripčných faktorov buď ako aktivátory, alebo ako inhibítory. V tejto práci sú popísané spôsoby regulácie transkripcie u baktérií rodu Mycobacterium, ku ktorým zahrňujeme aj patogénne baktérie M. tuberculosis a M. leprae. Baktérie tohto rodu vykazujú malú konzervovanosť promótorových oblastí, veľké množstvo sigma faktorov, veľký počet transkripčných faktorov, prítomnosť dvojkomponentových systémov a mnoho, zatiaľ málo preskúmaných, malých regulačných RNA.
|
host ::
RSS.