|
|
Úloha sirtuinů během formace prvojader po in vitro oplození prasečích oocytů
Maryníková, Veronika ; Žalmanová, Tereza (vedoucí práce) ; Miriama , Miriama (oponent)
Význam reprodukčních biotechnologií v posledních letech nezadržitelně stoupá. Umožňují dosáhnout vyšší užitkovosti hospodářských zvířat či zdokonalení léčebných
postupů v humánní medicíně. Pro rozvoj reprodukčních biotechnologií je zapotřebí zajistit dostatečné množství vývojově kompetentních oocytů a následně zdravých životaschopných embryí pro kultivaci v in vitro podmínkách. Klíčovým momentem, který následuje krátce po
oplození, je formace prvojader. Zajištění správného histonového kódu je nezbytné pro správný vývoj raného embrya. Při poruše histonového kódu může dojít k vývojovým defektům až k zániku embrya. Jedním z mechanismů účastnících se regulace histonového
kódu, ke kterému se v posledních letech obrací pozornost, jsou NAD+-dependentní histon deacetylázy, známé také jako sirtuiny. Tuto skupinu deacetyláz tvoří sedm izoforem, SIRT1-7, z nichž SIRT1 se zdá být klíčovým pro regulaci časného embryonálního vývoje.
Na základě dosavadních poznatků byla stanovena hypotéza, že SIRT1 je přítomen v prasečích zygotách a je zde zapojen do regulace formace prvojader. Pro experiment byly použity prasečí COCs, které byly vystaveny 44 hod. in vitro zrání. Po ukončení kultivace byly vybrány zralé oocyty a tyto byly dále použity pro in vitro oplození. Zygoty byly kultivovány spolu s inhibitorem sirtuinů, nikotinamidem, či se specifickým inhibitorem SIRT1, sirtinolem. Po 22 hod. kultivace in vitro byly zygoty podrobeny imunocytochemické lokalizaci acetylovaného a metylovaného histonu H3 na lysinu 9 (K9) a analýze obrazu.
Ze získaných výsledků je patrné, že SIRT1 je přítomný v prasečích zygotách, kde je jeho lokalizace směřována především do prvojader. Po inhibici SIRT1 byly patrné změny na hladině acetylace a metylace H3K9, kdy došlo k signifikantnímu nárůstu acetylovaného H3K9 a naopak poklesu methylovaného H3K9. Použití sirtinolu potvrdilo, že tyto změny histonového kódu způsobuje zejména SIRT1. Zapojení SIRT1 do regulace histonového kódu ve fázi formace prvojader prasat je však neuspokojivě probádaná oblast výzkumu, která vyžaduje podrobnější objasnění mechanismů účinků.
|
|
|
Histonový kód a jeho regulace během časného embryonálního vývoje prasete
Jelínková, Pavla ; Žalmanová, Tereza (vedoucí práce) ; Miriama, Miriama (oponent)
U samčího i samičího prvojádra zygoty dochází po oplození k epigenetickým změnám, od kterých se odvíjí kvalita zygoty a úspěšnost časného embryonálního vývoje savců. Mezi prvojádry zygoty je krátce po oplození patrná epigenetická asymetrie, kdy u samčího prvojádra probíhá aktivní demethylace DNA, zatímco DNA maternálního prvojádra zůstává methylováno. Navíc u samčího prvojádra dochází k procesu acetylace histonů chromatinu, zatímco genom samičího prvojádra si ponechává histony více methylované. Asymetrie prvojader a jejich epigenetický stav předvídá úspěšnost reprogramace genomu a tím úspěšnost embryonálního vývoje. Pro úspěšný vývoj embrya je tedy nezbytná správná formace obou prvojader zygoty, kterou regulují post-translační modifikace histonů utvářející tzv. histonový kód. Byla stanovena hypotéza, že tento histonový kód je regulován aktivitou NADP+-dependentních histon deacetyláz, sirtuinů.
V experimentu byly použity plně dorostlé prasečí oocyty, které byly po in vitro zrání oplozeny prasečími spermiemi. Po izolaci zygot, kultivovaných s přídavkem aktivátoru sirtuinů resveratrolu, byla provedena imunofluorescenční analýza přítomnosti acetylovaného a methylovaného histonu H3 na lyzinu K9 u prvojader zygoty. Z výsledků je u kontrolní skupiny patrná asymetrie mezi oběma prvojádry zygoty, kde samčí prvojádro vykazuje vyšší intenzitu acetylace a naproti tomu samičí prvojádro vyšší intenzitu methylovaného signálu. U všech pokusných skupin došlo po přídavku resveratrolu u samičího prvojádra k výraznému zvýšení intenzity signálu methylovaného histonu H3 na lyzinu K9 a naopak u prvojádra samčího k výraznému snížení intenzity signálu acetylovaného histonu H3 na lyzinu K9.
Sirtuiny jsou zapojeny do regulace histonového kódu v prasečí zygotě a lze se domnívat, že sehrávají také úlohu během dalšího embryonálního vývoje, což je předmětem dalšího studia.
|
|
|
Intracelulární distribuce enzymů uvolňujících sulfan ve zrajících oocytech prasete
Vondráková, Veronika ; Hošková, Kristýna (vedoucí práce) ; Tomáš, Tomáš (oponent)
Studium molekulárních mechanizmů regulujících reprodukční procesy je nezbytné pro zvyšování efektivnosti reprodukčních biotechnologií, které jsou v chovech zvířat využívány čím dál častěji. Klíčovou součástí mnoha biotechnologických metod je kultivace oocytů, která simuluje přirozené podmínky vaječníků. Tato simulace je ovšem stále nedokonalá a je limitujícím faktorem úspěšnosti vzniku oplození schopných savčích oocytů.
Meiotické zrání ovlivňuje mnoho faktorů, mezi které patří například gasotransmiter sulfan (H2S). Donedávna byl sulfan známý pouze jako toxický plyn znečisťující životní prostředí. Dnes víme, že sulfan je za nízkých koncentrací důležitou signální molekulou s nesčetným množstvím fyziologických funkcí. Sulfan je produkován enzymy CBS, CTH a 3-MPST v různých tkáních těla včetně reprodukční soustavy.
Na základě dostupných informací byla stanovena hypotéza, že enzymy odpovědné za endogenní produkci sulfanu, CBS, CTH a 3-MPST, jsou přítomné v prasečích oocytech a jejich přítomnost v buněčných organelách se mění během meiotického zrání. Cílem této práce bylo tuto hypotézu ověřit pomocí kultivace prasečích oocytů, imunocytochemické detekce mitochondrií, endoplazmatického retikula a enzymů uvolňujících endogenní sulfan a pomocí kolokalizační analýzy.
Vyhodnocením výsledků bylo zjištěno, že enzymy uvolňující sulfan, CBS, CTH a 3-MPST, jsou přítomny v prasečích GV oocytech i v oocytech dozrálých do stádia MII po 48 hod. in vitro kultivaci. Bylo také zjištěno, že během meiotického zrání dochází ke změnám distribuce těchto enzymů v buněčných organelách oocytu. V mitochondriích docházelo k statisticky významným změnám distribuce enzymů 3-MPST a CBS. U enzymu 3-MPST došlo ke vzrůstu hodnot kolokalizačních koeficientů, naopak u enzymu CBS došlo k poklesu těchto hodnot. V endoplazmatickém retikulu docházelo k statisticky významným změnám distribuce všech tří sulfan-uvolňujících enzymů. Hodnoty kolokalizačních koeficientů pro enzymy CBS a 3-MPST vzrostly, naopak pro kombinaci endoplazmatického retikula a CTH klesly. Tyto poznatky jsou důležité pro objasnění role gasotransmiteru sulfanu během meiotického zrání oocytů savců a jejich aplikaci ve šlechtění hospodářských zvířat i asistované reprodukci člověka
|
|
|
Interakce enzymů uvolňujících sulfan v prasečích oocytech během meiotického zrání
Jiříček Hasalová, Simona ; Hošková, Kristýna (vedoucí práce) ; Tomáš, Tomáš (oponent)
Reprodukční biotechnologie v současné době představují významný vědní obor, který na základě dostatečného množství plnohodnotných oocytů dozrálých v in vitro podmínkách umožňuje nabývat na své efektivitě. Meiotické zrání představuje komplexní proces, na jehož regulaci se podílí široké spektrum faktorů, včetně malých plynných molekul, tzv. gasotransmiterů. Tyto plyny vykazují řadu fyziologických funkcí v organizmu a posledním tímto objeveným gasotransmiterem je sulfan (H2S).
Cílem této diplomové práce bylo ověřit hypotézu, podle které jsou v prasečích oocytech přítomny enzymy produkující H2S (CBS, CTH, 3-MPST), jejich distribuce je ve vzájemné interakci a jejich společné působení ovlivňuje průběh meiotického zrání. Výsledná data byla získána na základě imunocytochemického barvení a kolokalizační analýzy.
Výsledky potvrdily přítomnost H2S-uvolňujících enzymů v prasečích oocytech. Zároveň byla potvrzena funkce těchto enzymů v souvislosti s regulací meiotického zrání, kdy oocyty kultivované spolu s trojkombinací inhibitorů H2S-uvolňujících enzymů dozrávaly pomaleji. Výsledky také poukázaly střední korelační závislost enzymů CBS, CTH a 3-MPST. V případě kombinace CBS a 3-MPST byla zaznamenána vysoká korelační závislost, a tím potvrzena jejich interakce jak v nezralých oocytech, tak i v in vitro dozrálých oocytech.
Je zřejmé, že doposud prostudované účinky H2S jsou jen zlomkem schopností, kterými tato signální molekula disponuje. Pro popsání a vysvětlení mechanizmů působení H2S je zapotřebí dalších experimentů.
|
|
|
Molekulární mechanizmus účinku sulfanu v průběhu meiotického zrání prasečích oocytů
Veselá, Andrea ; Hošková, Kristýna (vedoucí práce) ; Tomáš, Tomáš (oponent)
V současné době jsou reprodukční biotechnologické metody na vzestupu, ale jejich rozvoj a uplatnění v širším managementu reprodukce závisí na získání dostatečného počtu kvalitních oocytů kultivovaných v in vitro podmínkách. Předpokladem tohoto požadavku je vytvoření optimálních podmínek v průběhu kultivace oocytů.
Pochopení a znalost procesů, ke kterým v oocytu během zrání dochází, je důležitou a nezbytnou podmínkou optimalizace procesu kultivace oocytů v in vitro podmínkách a zisku dostatečného množství kvalitních oocytů v metafázi II. meiotického dělení. Je známo velké množství mechanismů, které zrání oocytů ovlivňují a řídí, nicméně i přesto nelze tvrdit, že by tento proces byl plně objasněn a prostudován. Jedním z faktorů, který má možnou úlohu v regulaci meiotického zrání oocytů je gasotransmiter sulfan (H2S), důležitá signální molekula endogenního původu.
Na základě studia H2S byla stanovena hypotéza, že H2S aktivně ovlivňuje průběh meiotického zrání prasečích oocytů prostřednictvím regulace klíčových signálních kaskád. Cílem práce bylo stanovit zapojení H2S do regulace signální kaskády MEK1-MAPK, odpovědné za iniciaci a průběh meiotického zrání oocytů, a kaskády MEK1-PARP-1, jako signalizaci podporující životaschopnost buněk. Pro tento účel byly použity prasečí oocyty, které byly kultivovány v modifikovaných médiích s přídavkem specifické kombinace inhibitorů enzymů (3Ki) nebo v kultivačním médiu s donorem H2S. Oocyty byly následně podrobeny imunocytochemickému barvení, fluorescenční mikroskopii a analýze obrazu.
Z výsledků je patrné, že H2S se podílí na regulaci meiotického zrání. Byla potvrzena hypotéza o vlivu endogenní produkce H2S na průběh meiotického zrání prasečích oocytů a ovlivnění signální kaskády MAPK. Na základě dosažených výsledků je však pravděpodobné, že signální kaskáda MEK1-PARP-1 není H2S ovlivněna, na rozdíl od MAPK signalizace, zahrnující zmíněnou MEK1 jako nadřazenou kinázu. MAPK kinázová aktivita je v oocytech signifikantně nižší po ošetření 3Ki. Další experimenty jsou pro detailnější pochopení těchto regulačních drah a k vhodnému ověření mechanizmu účinku H2S nezbytné, zejména pak pro úplné objasnění regulace cílových faktorů prostřednictvím post-translační modifikace
S-sulfhydratací.
|
|
|
Exprese izoforem hemoxygenázy ve stárnoucích oocytech prasete.
Poupalová, Michaela ; Sedmíková, Markéta (vedoucí práce) ; Lenka, Lenka (oponent)
Kvalita a oplozovací schopnost oocytů dozrávajících v in vitro podmínkách je zásadní pro jejich využití v biotechnologiích. V průběhu prodloužené kultivace dochází v oocytech k mnoha morfologickým a funkčním změnám, které mají za následek zejména snížení oplozovací schopnosti oocytů a vyšší míru apoptózy, polyspermie, partenogenetické aktivace a chromozomálních aberací. Tyto změny mají negativní vliv také na následný embryonální vývoj. Pochopení mechanismu stárnutí oocytů by tak mohlo zásadním způsobem přispět k rozvoji reprodukčních biotechnologií hospodářských zvířat a postupů v lidské asistované reprodukci.
Enzym hemoxygenáza (HO) katalyzuje oxidační štěpení hemu na biliverdin, oxid uhelnatý (CO) a železnaté ionty. Existují dvě izoformy hemoxygenázy, tj. HO 1 a HO 2. HO 1 má cytoprotektivní vlastnosti a v buňkách je exprimována zejména v reakci na působení stresových faktorů. HO 2 je zodpovědná spíše za bazální produkci CO. CO se řadí mezi gasotransmitery, což jsou endogenně produkované signální molekuly plynů. Význam systému HO/CO byl prokázán v reprodukční soustavě samců i samic. Jeho význam přímo v oocytech však není znám.
Cílem práce bylo ověřit hypotézu, že je HO exprimována v prasečích oocytech během jejich prodloužené kultivace v in vitro podmínkách a že se během stárnutí mění exprese jednotlivých izoforem. Hodnoceny byly oocyty ve stádiu metafáze druhého meiotického dělení (MII) a dále ve třech fázích stárnutí dle délky prodloužené kultivace, tj. 24, 48 a 72 hodin. HO 1 a HO 2 byly lokalizovány imunocytochemickou metodou.
Vyhodnocením experimentů bylo potvrzeno, že v průběhu stárnutí oocytů dochází k expresi obou izoforem HO, a to ve všech hodnocených oblastech, tj. v perichromozomální oblasti, korové oblasti a cytoplazmě. HO 1 se nachází zejména v perichromozomální oblasti a během stárnutí dochází ke statisticky významnému zvyšování intenzity signálu. V korové oblasti a cytoplazmě byl detekován statisticky významný rozdíl pouze v oocytech stárnoucích 72 hodin a intenzita signálu je v těchto oblastech slabší.
V případě HO 2 je signál rovnoměrně rozmístěn po celém oocytu a v porovnání s HO 1 je výrazně silnější. Ke statisticky významnému zvýšení intenzity signálu zde docházelo mezi oocyty ve stádiu MII a skupinou oocytů stárnoucích 24 hodin.
Během prodloužené kultivace se tedy významně zvyšuje exprese HO 2 v porovnání s dozrálými oocyty.
Vědecká hypotéza tak byla potvrzena v případě obou izoforem HO, tj. podařilo se lokalizovat HO 1 i HO 2 ve stárnoucích prasečích oocytech a zároveň zde dochází ke změnám v expresi v průběhu prodloužené kultivace. Z výsledků experimentů lze předpokládat, že se v oocytech nachází také produkty enzymatické činnosti HO 1 a HO 2, včetně CO a systém HO/CO se tak pravděpodobně uplatňuje v procesu stárnutí oocytů. Předpokladem je, že HO 1 zde působí zejména jako cytoprotektivní faktor, který by mohl pozitivně ovlivňovat kvalitu oocytů. HO 2 je pak zodpovědná zejména za bazální produkci CO, nicméně může hrát roli také v regulaci oxidačního stresu v oocytech.
Získaná data je nutné prověřit dalšími experimenty zaměřenými na lokalizaci a redistribuci obou izoforem během stárnutí oocytů. Předmětem dalších výzkumů by měl být také mechanismus účinku a konkrétní funkce HO 1 a HO 2 v oocytech.
|
|
|
Změny ve funkční morfologii reprodukčních orgánů prasnic linie MeLiM
Strnadová, Kristýna ; Chmelíková, Eva (vedoucí práce) ; Vilma, Vilma (oponent)
Melanom je nádorové onemocnění, které může kromě kůže napadat i jiné orgány, například oko, gastrointestinální a urogenitální trakt. Pro melanom je charakteristický jeho agresivní průběh a rezistence k terapii. Incidence tohoto onemocnění ve světě stále roste,
a to je jedním z důvodů, proč se v současné době zvyšuje i počet studií prováděných
na zvířecích modelech, které jsou tímto onemocněním postiženy. Jedním z příkladů vhodného zvířecího modelu pro studium tohoto nádorového onemocnění je linie prasat MeLiM (Melanoma-bearing Libechov Minipigs). U této linie prasat se vyskytuje dědičná forma melanomu. Zvláštností těchto prasat je, že u nich dochází ke kompletní spontánní regresi nádoru obvykle do tří měsíců po narození. Kompletní spontánní regrese nádoru se u člověka objevuje jen velmi vzácně. Byly však objeveny podobnosti v oblasti biochemie a histopatologie
mezi melanomem vyskytujícím se u této linie prasat a melanomem postihujícím člověka. Díky těmto podobnostem je zvířecí model MeLiM velmi vhodný k výzkumu nádorového onemocnění.
Zvířecí model MeLiM je v oblasti reprodukce málo popsán. Lze se domnívat,
že se u prasnic linie MeLiM s dědičnou formou melanomu vyskytují změny ve funkční morfologii reprodukčních orgánů a dochází k abnormalitám v meiotickém zrání oocytů. Cílem práce bylo zjistit, zda se u prasat linie MeLiM vyskytují změny ve funkční morfologii reprodukčních orgánů a dochází k abnormalitám v meiotickém zrání jejich oocytů.
Potvrdili jsme, že prasata linie MeLiM mají menší reprodukční orgány než běžně chovaná plemena prasat. Na vaječnících prasnic této linie jsme pozorovali zvýšený počet ovariálních cyst, avšak oocyty získané od těchto prasnic nevykazovaly abnormality v meiotickém zrání, i když počet oocytů, které jsme získali, byl menší.
|
|
|
Vliv endokrinních disruptorů na reprodukci živočichů
Eretová, Nikola ; Chmelíková, Eva (vedoucí práce) ; Krejčířová, Romana (oponent)
Endokrinní disruptory jsou chemické látky, které svým působením na organizmus narušují funkci endokrinního systému a tímto mění rovnováhu fyziologických funkcí celého organizmu. Endokrinních disruptorů se vyskytuje v ekosystému velké množství, mimo akumulované látky v prostředí je nalézáme v celé řadě produktů, se kterými se běžně setkáváme. Nejčastěji se jedná o nejrůznější umělé hmoty, jako jsou obaly nápojů a jídel. Podle výskytu těchto chemických látek je lze rozdělit na endokrinní disruptory syntetické a přírodní. Endokrinní disruptory se vyznačují dlouhým poločasem rozpadu a výraznou bioakumulací. Do organizmu škodlivé látky vstupují různými cestami, například prostřednictvím kůže a potravou. Vystavení organizmu endokrinním disruptorům působí negativně na jeho zdraví. Ve velkém rozsahu působí poruchy reprodukčních funkcí. Mimo účinky na reprodukci byl potvrzen škodlivý vliv na další tělesné soustavy, například nervový systém. U některých endokrinních disruptorů je potvrzený karcinogenní účinek. Endokrinní disruptory fungují především přes estrogenové, androgenové, progestinové nebo aryl hydrokarbonové receptory. Mnohdy jsou nebezpečnější jejich kombinace a metabolity, než látky samotné. Endokrinní disruptory mají škodlivý účinek na pohlavní orgány, narušují produkci pohlavních buněk, spermií a oocytů, ovlivňují proces oplození, uhnízdění zárodku v děloze, mají vliv také na embryonální vývoj a vývoj plodu, dokončení gravidity, porodní váhu. Změny mohou postihnout celý reprodukční systém. I přes velké množství studií zkoumající vliv endokrinních disruptorů na zdraví živočichů, existují nesrovnalosti, a proto je nutné ve výzkumu do budoucna intenzivně pokračovat.
|
|
|
Etická a psychosociální problematika dárcovského programu v asistované reprodukci
DVOŘÁKOVÁ, Alena
V diplomové práci jsem se zaměřila na problém nedobrovolné bezdětnosti, což je situace, kterou dnes řeší mnoho partnerských párů a má stále vzrůstající tendenci. Soustředila jsem se především na dárcovský program v asistované reprodukci. Popsala jsem způsob léčby pomocí dárcovských gamet, její etickou a legislativní problematiku. Empirická část je rozdělena na dva výzkumné projekty, každý z nich odpovídá jednomu z cílů práce. V prvním z nich je zmapována situace při rozhodování recipientských párů, zda vstoupí do programu AR s dárcovskými gametami a psychosociální následky této situace. Tato výzkumná část vychází z polostrukturovaných a nestrukturovaných interview s 10 páry a z pozorování. Data byla transkripována a následně podrobena kvalitativní analýze. V druhém výzkumu jsou uvedena data získaná nestrukturovaným interview s dárkyněmi a terénním pozorováním. Tato část se týká druhého cíle diplomové práce. V diskusi jsou rozhovory a pozorování vyhodnoceny a porovnány s literaturou, která se touto problematikou zabývá. Zaměřila jsem se především na otázku anonymity dárcovství, na motivaci dárkyň oocytů a následné porovnání s očekáváním příjemců. Z výzkumu byla stanovena hypotéza, že dárcovství gamet je složitý problém, kterým by se naše společnost měla podrobně zabývat. Tato práce může být využita pracovníky center asistované reprodukce. Může být použita i jako studijní materiál pro studenty Zdravotně sociální fakulty, zejména pro obor Porodní asistentka.
|
|
|
Psychosociální problematika infertility verbalizovaná pacienty ambulance pro léčbu neplodnosti.
DVOŘÁKOVÁ, Alena
Neplodnost (infertilita) je definována jako neschopnost otěhotnět po roce pravidelného nechráněného pohlavního styku. Existuje mnoho příčin neplodnosti, obě pohlaví jsou zastoupena stejně. Neplodnost je dnes pokládána za stresující životní okolnost, která vyvolává sérii psychosociálních reakcí. Ovlivňuje životní pohodu člověka a jeho schopnost normálně komunikovat a jednat. V atmosféře běžného společenského očekávání, že manželskému páru se mají rodit děti, je rodičovství chápáno dokonce jako jakási morální povinnost. Pokud není toto očekávání naplněno, pár se začne odlišovat a pociťovat stigmatizující efekt. Nejčastěji užívanou metodou léčby neplodnosti je in vitro fertilizace (IVF). Metoda spočívá v hormonální stimulaci vaječníků pacientky k vývoji a dozrání většího počtu vajíček. Vajíčka se po dosažení optimálního stupně vývoje získávají z vaječníků transvaginální punkcí a aspirací. Získaná vajíčka se oplodní spermiemi partnera. Po několikadenní kultivaci jsou embrya přenesena do dělohy ženy. Zvolená výzkumná strategie byla kvalitativní. Metodami získání dat byl neřízený rozhovor a pozorování. Sledovaný soubor tvořilo deset párů navštěvujících ambulanci pro léčbu neplodnosti. Tato práce si kladla za cíl zmapovat psychosociální problematiku infertilních párů. Otázky rozhovoru byly zaměřené na partnerské vztahy. Studie zdůrazňuje, že neplodnost je nemoc páru a že pokud se muž aktivně zapojuje do léčby, je to pro posílení vztahu velmi přínosné. Další okruh otázek byl zaměřen na komunikaci pacientů s rodinou a přáteli. Autorka sledovala i obtížnost zkombinování léčby se zaměstnáním. Hlavní důraz výzkumu byl zaměřen na zvládání léčby, na to, co pacientům léčbu usnadňuje a jak jim pracovníci center asistované reprodukce mohou pomoci léčbu lépe zvládat. Studie upozorňuje na nutnost tolerance a empatie personálu vůči pacientům. Dále poukazuje na možnosti optimálnější organizace v centrech a na užití vhodné terminologie. Práce může být využita hlavně pracovníky center asistované reprodukce.
|
host ::
RSS.