|
|
Rezonanční přenos energie ve studiu interakce polymerů a vezikul
Jízdná, Zuzana ; Kratochvíl, Matouš (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Předkládaná bakalářská práce se zabývala přípravou kataniontových vezikulárních systémů, které byly tvořeny tenzidy CTAB a SDS, pro studium jejich vzájemné interakce s polymerem hyaluronanem pomocí měření Försterova rezonančního přenosu energie. Nejprve byly připraveny koncentrační řady vezikulárních systémů s fluorofory. Použitými fluorofory byly DPH, perylen a fluorescein. Poté byla měřena doba života fluorescence vybraných fluoroforů, metodou TCSPC. Následně byly měřeny charakteristiky připravených vezikulárních systémů metodami DLS a ESL. Pro finální měření interakce vezikuly s polymerem byl na základě všech provedených měření zvolen vezikulární roztok, který obsahoval DPH o koncentraci 3·10-5 mol/l a hyaluronan. Byly testovány dvě molekulové hmotnosti hyaluronanu (300 a 900 kDa) o hmotnostních koncentracích 1, 5, 10, 50 a 100 mg/l. Měřením bylo potvrzeno, že dochází k jejich vzájemné interakci a tento systém by tedy mohl nalézt uplatnění v medicínském odvětví.
|
|
|
Organické luminofory s dlouhovlnnou emisí
Kolaříková, Adéla ; Kratochvíl, Matouš (oponent) ; Vala, Martin (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá studiem možnosti dosáhnout intenzivní fluorescence v červené oblasti spektra pomocí Försterova rezonančního přenosu energie (FRET) v nanočásticích. Nejprve byly studovány optické vlastnosti organických molekul, které by mohly být vhodné pro vytvoření tzv. host-guest (HG) systému tvořeného párem akceptor-donor. Studované molekuly byly založeny na derivátech difenylstilbenu obsahujícího elektron-donorovou skupinu difenylamin (DPA-DPS), která je pomocí konjugovaného systému dvojných vazeb spojena s lišící se elektron-akceptorovou skupinou. Použité akceptorové skupiny, tj. indandion (-IOO), vinyl (-V) a di(methoxykarbonyl)vinyl (-V(COOMe)2) se vzájemně liší strukturou a polaritou, která se projevila změnou polohy fluorescenčního spektra. Ve studovaných HG systémech látka DPA-DPS-IOO sloužila vždy jako host (G1) a látky DPA-DPS-V a DPA-DPS-V(COOMe)2 jako hostitel (H1 nebo H2). Nanočástice z těchto látek (G1H1 a G1H2) byly připraveny metodou nanoprecipitace. U obou těchto systému byl pozorován FRET. Při excitaci matrice byla energie přenesena na hosta G1, který následně fluoreskoval v dlouhovlnné oblasti. U nanočástic vytvořených ze systému G1H2 bylo dále pozorováno i zvýšení kvantového výtěžku fluorescence hosta a to jak v porovnání s práškovou formou, tak nanočásticemi vytvořených pouze ze samotného hosta, ze 7 % (prášek) a 3,1 % (nanočástice) na 14 %. U nanočástic systému G1H1 nebyl nárůst kvantového výtěžku fluorescence hosta pozorován. Z výsledků vyplynulo, že FRET může být účinný nástroj při vývoji nanočástic vykazující intenzivní dlouhovlnnou fluorescenci pro zobrazovací metody.
|
|
|
Tracking membrane permeabilization on single lipid vesicles - method development.
Gücklhorn, David ; Šachl, Radek (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent)
Proteinové komplexy se obtížně studují, obzvlášť pokud vznikají jen v membránovém prostředí a na velmi krátkou dobu. Toto je problematické například v případě fibroblastového růstového faktoru 2 (FGF2), což je protein s mnoha fyziologickými i patologickými funkcemi v lidském organismu. Hraje zásadní roli v rozvoji různých nádorových onemocnění, protože braní apoptóze buněk pomocí autokrinní signalizace a také stimuluje angiogenezi. Zároveň je v současné době zkoumána možnost jeho uplatnění v léčbě zranění periferního nervstva. Přestože je důkladně zkoumán již řadu let, mechanismus jeho translokace do mezibuněčného prostoru, kde vykonává svou funkci, nebyl zcela objasněn. Pro studium komplexních systému, jako jsou membránové póry tvořené FGF2, jsme vyvinuli jednoduchou a efektivní metodu fluorescenční mikroskopie. Tato metoda se jmenuje dvojitá permeabilizační esej jednotlivých vezikulů (DLSGA). Využívá lipidové vezikuly (GUVs) pro simulaci buněčné membrány. V jediném experimentu je možné sledovat až 300 jednotlivých vezikulů a tvorbu pórů v jejich membráně. Během třech měření za různých podmínek získáváme detailní informaci o dynamice otevírání pórů na každém vezikulu. Na základě těchto měření je možné jednotlivé vezikuly rozdělit do šesti skupin podle toho, jestli se na nich tvořili póry a jak...
|
|
|
Využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí
Johaníková, Klára ; Bezděková,, Jaroslava (oponent) ; Pavelicová, Kristýna (vedoucí práce)
Diplomová práce s názvem „Využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí“ je zaměřená na využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí pomocí elektromigračních metod a Försterova resonančního přenosu energie (FRET). Cílem této práce bylo vytvoření biokonjugátu proteinu metallothioneinu (MT) s kvantovými tečkami (QDs) a komerčními barvivy. Mezi těmito konjugáty byl následně studován FRET. QDs byly syntetizovány za působení UV záření a konjugace s MT byla provedena přes karbodiimidový zerolengthcrooss-linker (EDC/sulfo-NHS), který slouží k aktivaci karboxylových skupin a umožňuje biokonjugaci ligandu kovalentní vazbou. Díky vysokému podílu cysteinů v MT, má tento protein velmi vysokou afinitu ke kovům. Podílí se také na vychytávání volných radikálů a jsou i studie, které dokazují, že dochází ke zvýšené expresi MT v oblasti rakovinných buněk-nádorů. Pozornost byla věnována i studiu dimerizace MT, která vede k pochopení oxidativní dimerizace MT a tím může přispět k pochopení vzniku volných radikálů v těle a k prohloubení znalostí o neurodegenerativních poruchách jako je Parkinsnova nebo, Alzheimerova choroba či amyotrofická laterální skleróza. Vznik dimeru MT, byl potvrzen přenosem energie mezi donorem (QDs) a akceptorem (komerční barvivo-cyanin) skrze fyzikální jev FRET i pomocí MALDI-TOF-MS.
|
|
|
Spliceosome assembly
Hausnerová, Viola ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Chalupníková, Kateřina (oponent)
Introny jsou vystřiženy z eukaryotických transkriptů a exony jsou spojeny dohromady během procesu zvaného sestřih pre-mRNA. Sestřih je katalyzován sestřihovým komplexem. Jedná se o velký ribonukleoproteinový komplex složený z pěti malých jaderných RNA a více než stovky proteinů. Tento komplex rozpoznává 5' sestřihové místo, místo větvení a 3' sestřihové místo a následně provádí dvě transesterifikační reakce, jejichž výsledkem je zralá molekula mRNA. V rámci časného sestřihového komplexu je 5' sestřihové místo definováno pomocí U1 snRNP a na rozpoznání místa větvení a 3' sestřihového místa se podílí U2 pomocný faktor (U2 auxiliary factor, U2AF). Spolupráce sestřihových míst byla částečně popsána in vitro, ale situace in vivo není dosud zcela objasněna. V této studii jsme použili fluorescenční rezonanční energetický transfer (Fluorescence resonance energy transfer, FRET) a RNA imunoprecipitaci (RIP) k popsání časných kroků skládání sestřihového komplexu. Abychom detekovali interakce proteinů na RNA molekule přímo v buněčném jádře, uplatnili jsme sestřihové reportéry kódující -globinový gen a vlásenky z fága MS2. Výsledky FRETu ukazují, že intaktní 5' sestřihové místo je vyžadováno pro vazbu U2AF35 na 3' sestřihové místo a že vazba U1C je částečně omezena v přítomnosti mutace 3' sestřihového místa. Dále jsme...
|
|
|
Analysis of Src dynamics in cellular structures
Pelantová, Markéta ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent)
Src kináza je klíčovým elementem mnoha signálních drah, které ovlivňují buněčné procesy jako diferenciaci, proliferaci, motilitu či migraci. Deregulace její aktivity je spojena s rozvojem rakoviny. Pochopení její funkce v buňce je tedy zásadní. Aktivita Src kinázy přímo koreluje s její konformací; v aktivním stavu zaujímá otevřenou konformaci, ve stavu inaktivním je v uzavřené konformaci, stabilizované intramolekulárními interakcemi. Detekce konformace Src kinázy tak může být použita ke sledování její aktivity. V této práci byl vylepšen biosenzor, detekující změnu konformace Src kinázy a založený na metodě FRET, a to použitím mNeonGreenu jako nového akceptorového fluoroforu v již existujícím designu. Vlastnosti nového senzoru byly porovnány se senzorem původním. Nový senzor je schopen detekovat konformační změny Src kinázy a lze ho stabilně exprimovat v buňkách. Analýza aktivity Src kinázy ve fokálních adhezích potvrdila zvýšenou aktivitu Src v těchto strukturách. Ačkoli nový biosenzor v porovnání s původním nevykazuje vyšší citlivost ke konfromačním změnám Src, stále se jedná o validní a užitečný nástroj pro studium aktivity Src kinázy, který je díky vyššímu jasu mNeonGreenu vhodnější pro mikroskopické experimenty. Klíčová slova: Src, FRET, biosenzor, mikroskopie živých buněk, mNeonGreen
|
|
|
Příprava a testování nového proteinového senzoru mechanické tenze
Kolomazníková, Veronika ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Novotný, Ivan (oponent)
Protein p130Cas (lidský ortholog BCAR1) je jedním z hlavních substrátů kinázy Src a hraje tak důležitou roli v nádorové transformaci. Zvýšená exprese BCAR1 koreluje s růstem primárního nádoru, jeho agresivitou a zhoršenou prognózou onemocnění. Ve chvíli, kdy je protein lokalizován do fokálních adhezí slouží jako buněčný mechanosenzor a zprostředkovává interakci buňky s extracelulárním prostředím. Pro fungování proteinu jsou klíčové kotvící domény SH3 a CCH spolu se substrátovou doménou, která může být vlivem aplikované tenze natahována. Diplomová práce představuje nově zkonstruovaný FRET-biosenzor mechanické tenze založený na struktuře proteinu p130Cas. Senzor využívá kotvící domény p130Cas, díky kterým lokalizuje do fokálních adhezí a může detekovat mechanickou tenzi v živých buňkách. Klíčová slova: p130CAS, FRET, fokální adheze, mechanorecepce
|
|
|
Metody sledování buněčných procesů v reálném čase
Švecová, Iva ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Groušl, Tomáš (oponent)
Cílem této práce je poskytnout přehled metod využívaných ke sledování procesů v živých buňkách v reálném čase se zaměřením na sledování signálních drah. První, neobsáhlejší část práce se zabývá metodami využívajícími fluorescenci, poté se zmíníme také o bioluminiscenčních metodách a metodách nevyžadujících značení. V sekci o fluorescenčních metodách si nejprve představíme typy fluoroforů a příslušné způsoby značení. Následně se podíváme na jednotlivé přístupy. Začneme dvěma způsoby designu biosenzorů, následovat budou tři metody umožňující sledování kinetiky molekul, poté se seznámíme s metodou FLIM využívanou ke sledování prostředí kolem fluoroforu a skončíme s dvěma technikami vylepšujícími rozlišení. U každé techniky si vysvětlíme její princip a uvedeme si příklady využití. Na závěr se podíváme na příklad sledování signální dráhy.
|
|
|
Studium stability vezikulárních systémů pomocí technik fluorescenční spektroskopie
Máčala, Jakub ; Venerová, Tereza (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá studiem stability a fúze kataniontových vezikulárních systémů na bázi CTA-DS pomocí Försterova rezonančního přenosu energie (FRET). Pro měření bylo použito metody Time-Correlated Single Photon Counting. Nejprve byly změřeny excitační a emisní spektra sond z prostředí kataniontových vezikul a byly navrhnuty donor-akceptorní páry: 5-hexadecanoylaminofluorescein s Oktadecyl Rhodaminem B, Bodipy 493/503 s Oktadecyl Rhodaminem B nebo DiI, Perylen s 5-hexadecanoylaminofluoresceinem a DiO s DiI. Poté byla provedena měření dob života vybraných párů z prostředí vezikul o různém obsahu cholesterolu za účelem sledování FRET umožněného fúzí vezikul. Bylo zjištěno, že není možné použít DiO jako donor, jelikož dochází k jeho nízké solubilizaci do vezikul. Také nebylo možné použít Bodipy, jelikož byla prokázána tvorba jeho excimerů. Při použití fluoresceinu jako donoru bylo zjištěno, že mezi jeho molekulami dochází k homo-fret, proto do systému byly přidány pouze neznačené vezikuly a tímto způsobem bylo možné fúzi detekovat, a to až na výjimky i v delším období. Také u páru perylen-fluorescein byla prokázána schopnost sledovat fúzi vezikul, ale s výjimkou systému s obsahem cholesterolu 43 mol. % pouze v krátkém časovém úseku.
|
|
|
Příprava a testování nového proteinového senzoru mechanické tenze
Kolomazníková, Veronika ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Novotný, Ivan (oponent)
Protein p130Cas (lidský ortholog BCAR1) je jedním z hlavních substrátů kinázy Src a hraje tak důležitou roli v nádorové transformaci. Zvýšená exprese BCAR1 koreluje s růstem primárního nádoru, jeho agresivitou a zhoršenou prognózou onemocnění. Ve chvíli, kdy je protein lokalizován do fokálních adhezí slouží jako buněčný mechanosenzor a zprostředkovává interakci buňky s extracelulárním prostředím. Pro fungování proteinu jsou klíčové kotvící domény SH3 a CCH spolu se substrátovou doménou, která může být vlivem aplikované tenze natahována. Diplomová práce představuje nově zkonstruovaný FRET-biosenzor mechanické tenze založený na struktuře proteinu p130Cas. Senzor využívá kotvící domény p130Cas, díky kterým lokalizuje do fokálních adhezí a může detekovat mechanickou tenzi v živých buňkách. Klíčová slova: p130CAS, FRET, fokální adheze, mechanorecepce
|
host ::
RSS.