|
|
Analytical approaches to study group interactions of azole pesticides with important biological active compounds
Kovač, Ishak ; Jaklová Dytrtová, Jana (vedoucí práce) ; Száková, Jiřina (oponent) ; Navrátil, Tomáš (oponent)
Cílem této disertační práce bylo vyvinout robustní analytickou techniku pro separaci a detekci reziduí triazolových fungicidů (TAF) a také studovat vliv TAF na rostlinu a biologicky aktivní látky. Je zde popsán vývoj metodiky pro stanovení reziduí TAF v reálných vzorcích (rajče "Sweet Cherry" - Solanum lycopersicum L.) pomocí kapilární elektroforézy. Vyvinutá metodika byla validována pro laboratorní použití pří relativně krátké době analýzy a nízkých nákladech na analýzu s dostatečnou mezí detekce a kvantifikace. Další část této disertační práce je zaměřena na vliv TAF na rajče jedlé, jeho růst, fruktifikaci a také vliv na biologicky aktivní látky. Kapilární elektroforéza je analytická technika, vyznačující se při minimální spotřebě vzorku (nL) obecně vysokou účinností při separaci malých molekul. V metodice je využito cyklodextrinem modifikované micelární elektrokinetické chromatografie k separaci směsi TAF získaných ze slupek rajčat. Optimální podmínky pro separaci byly nalezeny v elektrolytu tvořeného kyselinou fosforečnou a Tris (o koncentraci 100 mM), 20% v/v methanolem, se zdánlivým p[H+ ] 4,8. Složkami směsné micelární pseudostacionární fáze byly iontový deter- gent dodecylsulfát sodný (SDS) o koncentraci 15 mM a náhodně sulfátovaný gama- cyklodextrin (17,5 mg/mL). Metodické limity...
|
|
|
Analýza a charakterizace liposomů pomocí kapilární elektroforézy
Orgoníková, Andrea ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Coufal, Pavel (oponent)
3 Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá analýzou tří různých typů liposomů pomocí kapilární elektroforézy s UV-VIS a laserem indukovanou fluorescenční detekcí a využitím liposomů jako pseudostacionární fáze pro separace analytů metodou liposomální elektrokinetické chromatografie. V rámci experimentů s liposomy DSPC-DSPG-PEG2000-DMPE s enkapsulovaným 5-fluoruracilem byl v elektroferogramech úspěšně identifikován pík liposomů s enkapsulovaným 5-fluoruracilem a pík volného 5-fluoruracilu. Oba píky vykazovaly shodné absorpční spektrum v UV oblasti, čímž byla potvrzena jejich identita. Bylo tedy ověřeno, že kapilární elektroforéza s UV-VIS detekcí je použitelná pro separaci a detekci volného a enkapsulovaného léčiva, což je nezbytné pro stanovení účinnosti enkapsulace. Sledováním změny efektivní mobility analytů po přídavku liposomů do základního elektrolytu byla hodnocena použitelnost zkoumaných liposomů v liposomální elektrokinetické chromatografii. Změna mobility byla pozorována u záporně nabitého 5-fluoruracilu a kladně nabitého tryptaminu a p-toluidinu. Absolutní hodnota efektivní mobility záporně nabitého 5-fluoruracilu se snížila vlivem interakcí s liposomy o 18,2 % a efektivní mobilita kladně nabitých analytů tryptaminu a p-toluidinu o 9,2 a 16 %. Prázdné liposomy DSPC-DSPG-PEG2000-DMPE-NBDPC s...
|
|
|
Elektroforetické stanovení oxidované a redukované formy glutathionu v rostlinném materiálu
Durychová, Eva ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kubíčková, Anna (oponent)
Tato práce vychází z dříve publikované metody pro stanovení dvaceti proteinogenních aminokyselin pomocí kapilární elektroforézy s bezkontaktní vodivostní detekcí a zabývá se možností jejího využití ke stanovení oxidované (GSSG) a redukované (GSH) formy glutathionu s aminokyselinami. Teoretická část se nejdříve věnuje stručnému představení vlastností a významu glutathionu a jeho stabilizací vůči autooxidaci, konkrétně alkylací pomocí N-ethylmaleimidu (NEM) vázajícím se na GSH za vzniku alkylované formy (GSH-NEM). Dále se věnuje stručnému souhrnu dostupných metod k stanovení glutathionu, s detailnějším zaměřením na již vyvinuté metody kapilární zónové elektroforézy. Na závěr ve zkratce představuje elektroforetickou metodu pro stanovení dvaceti proteinogenních aminokyselin, ze které tato práce vychází. V praktické části se nachází postup, s jakým bylo zaváděno stanovení obou forem glutathionu do metody pro stanovení proteinogenních aminokyselin. Nejprve byla testována zjednodušená, časově méně náročná metoda v kratší 50,0 cm kapiláře bez hydroxyethylcelulózy, kde byly obě formy glutathionu separovány na základní linii během 10 minut. U této metody byly zjištěny relativní směrodatné odchylky ploch píků (GSH 2,1 %; 1,2 GSSG %; GSH-NEM 2,2%) a jejich migračních časů (GSH 0,56 %; GSSG 0,59 %; GSH-NEM 1,31...
|
|
|
Využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí
Johaníková, Klára ; Bezděková,, Jaroslava (oponent) ; Pavelicová, Kristýna (vedoucí práce)
Diplomová práce s názvem „Využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí“ je zaměřená na využití fluorescenčních metod pro studium proteinových interakcí pomocí elektromigračních metod a Försterova resonančního přenosu energie (FRET). Cílem této práce bylo vytvoření biokonjugátu proteinu metallothioneinu (MT) s kvantovými tečkami (QDs) a komerčními barvivy. Mezi těmito konjugáty byl následně studován FRET. QDs byly syntetizovány za působení UV záření a konjugace s MT byla provedena přes karbodiimidový zerolengthcrooss-linker (EDC/sulfo-NHS), který slouží k aktivaci karboxylových skupin a umožňuje biokonjugaci ligandu kovalentní vazbou. Díky vysokému podílu cysteinů v MT, má tento protein velmi vysokou afinitu ke kovům. Podílí se také na vychytávání volných radikálů a jsou i studie, které dokazují, že dochází ke zvýšené expresi MT v oblasti rakovinných buněk-nádorů. Pozornost byla věnována i studiu dimerizace MT, která vede k pochopení oxidativní dimerizace MT a tím může přispět k pochopení vzniku volných radikálů v těle a k prohloubení znalostí o neurodegenerativních poruchách jako je Parkinsnova nebo, Alzheimerova choroba či amyotrofická laterální skleróza. Vznik dimeru MT, byl potvrzen přenosem energie mezi donorem (QDs) a akceptorem (komerční barvivo-cyanin) skrze fyzikální jev FRET i pomocí MALDI-TOF-MS.
|
|
|
Využití kapilární elektroforézy v rámci forenzních molekulárně genetických zkoumání
Grafnetterová, Anna ; Doubková, Klára (vedoucí práce) ; Coufalová, Pavla (oponent)
4 Abstrakt Kapilární elektroforéza (CE) je metoda založená na principech tradiční deskové elektroforézy. Díky moderním způsobům fluorescenčního značení a jeho detekce, dosahuje vyšší spolehlivosti analýzy a přesnějších výsledků. Tato metoda je využitelná v mnoha oborech, kde dokonce může nahradit doposud používané metody jako je např. vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). Důležité využití CE je ve forenzním zkoumání, kde se jedná především o identifikaci jedince na základě analýzy DNA i z velmi malého množství materiálu. Tím se zabývá tzv. STR analýza, která pro své účely využívá krátké tandemové repetice (STR) vykazující vysokou variabilitu v populaci. K získání správných dat je důležité odpovídající vybavení, přístroje, softwary, kity, na jejichž vývoji se podílejí i komerční firmy jako je Promega Corporation a Applied Biosystems. Celá analýza vede k získání DNA profilu a jeho vyhodnocení na základě shody vzorků získaných na místě činu a kontrolních (srovnávacích) vzorků. STR analýzu lze využít kromě lidské DNA i u zvířecí DNA zejména v chovu koní, skotu apod., kde napomáhá určení původu jedince a výběru jedince s nejlepšími znaky. Klíčová slova: kapilární elektroforéza fluorescenční značení STR STR analýza DNA profil
|
|
|
Separace a stanovení možných produktů enzymového štěpení 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl-β-D-chitobiosidu pomocí kapilární elektroforézy
Velvarská, Romana ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kalíková, Květa (oponent)
Tato práce se zabývá vývojem a optimalizací podmínek metody, kterou lze využít k porovnání aktivity enzymu β-N-acetylhexosaminidasy při hydrolýze jejího přirozeného substrátu a tvz. chromogenního substrátu, který se často využívá při studiu enzymové kinetiky. Jako substrát pro štěpení byl zvolen 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl-β- D-chitobiosid. Tento oligosacharid obsahuje vazbu, kterou enzym štěpí v přirozeném substrátu, a zároveň také vazbu, která se vyskytuje v substrátu chromogenním. Pro stanovení produktů, jež vznikají při enzymatické hydrolýze 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl- β-D-chitobiosidu byla využita kapilární zónová elektroforéza. Nejprve bylo nutno najít optimální složení základního elektrolytu, tedy jeho hodnotu pH a koncentraci. Optimálním základním elektrolytem byl roztok tetraboritanu sodného o koncentraci 25 mmol/l a hodnotě pH 10,25. Následně byla zjištěna opakovatelnost měření, kalibrační závislosti a linearita, limit detekce a limit kvantifikace. Opakovatelnost migračních časů se pohybovala do 0,6%, opakovatelnost plochy píků pak v rozmezí 2,5 až 6,3%. Limity detekce metody byly v rozmezí 0,005-0,120 mmol/l. Nakonec byla optimalizovaná metoda úspěšně použita ke sledování průběhu skutečného enzymového štěpení.
|
|
|
Porovnání gelové a kapilární elektroforézy bílkovin
Krbec, Michal ; Franěk, Tomáš (vedoucí práce) ; Kotaška, Karel (oponent)
Elektroforéza sérových proteinu je jednou z metod užívaných v laboratorní diagnostice patologických stavu, ale i k výzkumným úcelum. Jde o jednostupnovou metodu, pri níž dochází k izolaci jednotlivých proteinu ze smesi (nejcasteji krevních bílkovin) v elektrickém poli v prítomnosti vhodného pufru a na vhodném nosici na základe jejich ruzné pohyblivosti, závislé na jejich povrchovém náboji a molekulové hmotnosti. Puvodne býval nosicem papír, pozdeji acetátcelulózová membrána a nyní již témer výhradne agaróza (cištený agar s nízkou endoosmózou), prípadne polyakrylamid (PAA). Mým úkolem v této práci bylo analyzovat sérii vzorku metodou gelové elektroforézy a následne analyzovat stejnou sérii i metodou kapilární elektroforézy. Výsledky získané obema metodami jsem zpracoval numericky, vzájemne porovnal a statisticky zhodnotil. Výstupem mojí práce je porovnání gelové a kapilární elektroforézy, zhodnocení výhod, nevýhod a zejména rozdílu mezi obema metodami.
|
|
|
Využití kapilární elektroforézy s UV fotometrickou a hmotnostně spektrometrickou detekcí s ionizací elektrosprejem ke studiu interakcí látek
Konášová, Renáta ; Jaklová Dytrtová, Jana (vedoucí práce) ; Mikšík, Ivan (oponent) ; Tůma, Petr (oponent)
Kapilární elektroforéza (CE) je vysoce účinná separační metoda založená na rozdílné rychlosti pohybu iontů v kapalném prostředí v elektrickém poli. Běžně se používá v analytických laboratořích a díky odlišnému principu separace slouží jako komplementární metoda k chromatografickým metodám (zejména HPLC a UHPLC). Vedle využití CE pro kvantitativní/kvalitativní analýzu lze tuto metodu také použít pro studium fyzikálně-chemických vlastností látek, např. pro stanovení aciditních konstant slabých elektrolytů či konstant stability komplexů. Tato práce se zabývá využitím CE metod s UV fotometrickou detekcí (CE-UV) pro stanovení fyzikálně chemických charakteristik látek (aciditní konstanty fungicidů a konstanty stability komplexů dibenzo-18-crown-6, benzo-18-crown-6 a 18-crown-6 etherů s ionty kovů v hydro- organických směsných rozpouštědlech) a možnostmi využití afinitní CE s hmotnostně spektrometrickou detekcí s ionizací elektrosprejem (ACE-ESI/MS) pro studium nekovalentních interakcí látek. Pro spojení ACE-ESI/MS byla testována dvě rozhraní: i) rozhraní s porézní špičkou a ii) rozhraní s nano-tokem pomocné kapaliny. Byla studována schopnost připravených CE-MS rozhraní efektivně oddělit sprejovací napětí od napětí separačního a citlivost těchto rozhraní pro studované analyty. Konstanty stability...
|
|
| |
|
|
Determination of proteinogenic amino acids by high-performance separation techniques
Hodek, Ondřej ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent) ; Tůma, Petr (oponent)
(CZ) Proteinogenní aminokyseliny patří mezi základní stavební jednotky živých organismů. Proto byl v poslední době výzkum v metabolomice zaměřen na vývoj rychlých a citlivých analytických metod pro stanovení aminokyselin. Tato práce obsahuje dvě studie popisující vývoj vysoce účinných separačních metod pro kvantifikaci aminokyselin. V první studii byla vyvinuta metoda kapilární elektroforézy pro stanovení aminokyselin v rostlinách tabáku. Nedílnou součástí této studie byla optimalizace extrakce aminokyselin z rostlinného materiálu. Extrakce byla optimalizována postupem "design of experiments" (DoE), pomocí kterého byly vyhodnoceny faktory ovlivňující výtěžek extrakce aminokyselin. Nejdůležitějšími faktory byly objem a koncentrace extrakčního činidla (kyselina chlorovodíková), jejichž optimální hodnoty byly určeny pomocí "response surface methodology" (RSM). Poté byly aminokyseliny separovány pomocí kapilární elektroforézy s bezkontaktní vodivostní detekcí a stanoveny za použití kalibrace s vnitřním standardem, což přispělo ke zlepšení přesnosti metody. Druhá studie byla zaměřena na vývoj metody pro stanovení aminokyselin v lidské plasmě pomocí superkritické fluidní chromatografie. Jedním z cílů této studie bylo zvýšit rozpustnost aminokyselin v mobilní fázi bohaté na CO2. Nejdříve byla zvýšena...
|
host ::
RSS.