|
|
Příprava a charakterizace protilátek proti cytochromu P450 1A1
Vlasáková, Kateřina ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Mácová, Iva (oponent)
Rakovina je druhou nejčastější příčinou úmrtí v ČR. Maligní transformace buněk jsou způsobeny vznikem aduktů DNA nebo tvorbou reaktivních forem kyslíku. Jednou ze skupin enzymů, které katalyzují vznik těchto karcinogenních látek, jsou cytochromy P450, např. CYP1A1 a 1A2. V poslední době jsou velmi populární chemopreventivní doplňky stravy, které by měly snižovat riziko rakoviny. Jejich nadměrné užívání ale může vést k indukci CYP a naopak zvýšení rizika. Poznání cytochromů P450 může vést k účelnější farmakoterapii nebo dokonce prevenci rakoviny. Vhodným nástrojem pro studium proteinů je metoda "imunoblottingu", která využívá specifické vazby antigen- protilátka. K tomuto účelu mohou posloužit slepičí anti-peptidové protilátky. Výsledkem této práce bylo získání slepičích protilátek proti peptidu, který byl vybrán na základě sekvence potkaního CYP1A1 a literatury. Klíčová slova: Žloutkové protilátky, peptidové antigeny, ELISA, Western blot
|
|
|
Studium indukce intestinálních konjugačních enzymů doplňky stravy
Hrdinová, Johana ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Bárta, František (oponent)
Cytochromy P450 (CYP) jsou enzymy hrající důležitou roli při metabolismu exogenních látek (například léčiv, kancerogenů, polutantů) a účastnící se metabolismu hydrofobních endogenních substrátů (například sterolů, mastných kyselin, prostaglandinů). Cytochromy podrodiny CYP1A se účastní aktivace prekancerogenů. Jelikož konzumace potravních doplňků obsahujících chemopreventivní látky (například flavonoidy), které mohou bránit procesu kancerogeneze, v posledních letech výrazně stoupá, přestože tyto látky mohou mít na organismus také negativní účinek. Jsou totiž schopné cytochromy P450 indukovat, a tím navýšit riziko aktivace prekancerogenů. V této práci byl sledován indukční efekt některých flavonoidních látek: β-naftoflavonu, myricetinu, dihydromyricetinu a léčiva obsahujícího výtažek z červených listů vinné révy - Antistaxu®.
|
|
|
Příprava a charakterizace antipeptidových protilátek pro imunodetekci cytochromů P450
Mácová, Iva ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Koblas, Tomáš (oponent)
Cytochromy P450 jsou významné enzymy účastnící se metabolismu endogenních i exogenních látek. Jejich substrátem jsou také karcinogeny, které mohou aktivovat, čímž může docházet ke vzniku rakoviny. Pokud jsou tedy cytochromy P450, zodpovědné za aktivaci karcinogenů indukovány, riziko rakoviny se zvyšuje. Jedním z induktorů těchto enzymů jsou i chemopreventivní látky, které jsou v současnosti velmi oblíbené a doporučované. Proto by měl být sledován vliv chemopreventivních látek na cytochromy P450 a vznik rakoviny. Cytochromy P450 se nejčastěji vyskytují v játrech. Nicméně existují také formy, které nebyly dosud prokázány v žádné zdravé lidské tkáni, ale jejich zvýšená exprese byla zjištěna v nádorech. Z tohoto důvodu by mohly sloužit k diagnostice a prognóze rakoviny. Mezi tyto cytochromy patří CYP2S1 a 2W1, které mohou být prognostickými markery kolorektální rakoviny. Proto by bylo vhodné mít nástroje k detekci těchto enzymů. Jednou z možností je imunodetekce cytochromů P450 technikou "Western blot" pomocí specifických protilátek. Nyní jsou nejčastěji využívány savčí protilátky (IgG), avšak protilátky izolované z vaječného žloutku (IgY) získávají na popularitě zejména kvůli velkému množství nesporných výhod. Pro přípravu peptidických imunogenů byly nejprve z primární struktury CYP2S1 a 2W1 vybrány...
|
|
|
Vliv heterodimerizace sestřihových variant metabotropního glutamátového receptoru 1a a 1b na nitrobuněčnou distribuci receptorových komplexů
Dvořáková, Michaela ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
L-glutamát je hlavním excitačním neuropřenašečem v centrální nervové soustavě (CNS) obratlovců, který může zprostředkovat synaptický přenos skrze ionotropní receptory nebo jej ovlivňovat prostřednictvím aktivace metabotropních glutamátových receptorů (mGlu receptory). Glutamátové receptory jsou jako přenašeče signálů v mozku nepostradatelné. Hlavní úlohou metabotropních glutamátových receptorů je zprostředkování pomalých excitačních a inhibičních odpovědí prostřednictvím aktivace druhých poslů a regulace vápníkových a draslíkových kanálů. Glutamatergní nervový přenos má vliv na synaptickou plasticitu, různé typy paměti, učení, motorickou koordinaci a neuronální vývoj. Na druhou stranu je však glutamát spojen s excitotoxicitou, která je jednou z příčin patogenity některých chronických neurodegenerativních chorob jako jsou Alzheimerova, Parkinsonova či Huntingtonova nemoc. Metabotropní glutamátové receptory mohou být terapeutickými cíli pro léčbu psychiatrických a neurologických onemocnění. Cílený transport membránových receptorů do různých částí neuronů podmiňuje neuronální polaritu a má tudíž nezanedbatelný vliv na přijímání a přenos extracelulárních signálů. Tato práce se zabývá skladbou metabotropního glutamátového receptoru 1, konkrétně potvrzuje heterodimerizaci sestřihových variant mGluR1a a mGluR1b ve...
|
|
|
Protilátková odpověď specifických hostitelů vůči antigenům ptačích schistosom
Turjanicová, Libuše ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Kolářová, Libuše (oponent)
Tato práce zaměřená na humorální odpověď specifických hostitelů proti antigenům různých vývojových stadií ptačích schistosom T. regenti a T. szidati navazuje na předchozí výzkum protilátkové odpovědi u nespecifických hostitelů (myš, člověk). Pomocí metod ELISA a na western blotu byla testována séra experimentálně nakažených kachen a séra z ulovených divokých kachen. Séra byla odebírána v předem určených intervalech. Výsledky ELISA testu ukazují průběh humorální odpovědi po infekci ptačími schistosomami. Po infekci T. regenti se 20. d.p.i. (den po infekci) signifikantně zvýšila hladina specifických protilátek IgY proti homogenátu cerkárií T. regenti. U kachen nakažených druhem T. szidati nebyl podobný vývoj zaznamenán. Změny hladiny specifických IgM proti homogenátu cerkárií T. szidati byly zaznamenány pouze u kachen nakažených v době plné imunokompetence a u opakovaně infikovaných kachen. Jednalo se o mírné zvýšení hladiny IgM 10. d.p.i. U ulovených kachen nebyla při celkovém vyšetření prokázána infekce ptačími schistosomami, což potvrzují i výsledky ELISA. Protilátky IgY z sér kachen infikovaných T. regenti na imunoblotu silně rozpoznávaly 2 antigeny v oblasti 49-47 kDa a 47-45 kDa. Objevily se i další reakce, které však nebyly zaznamenány u všech jedinců. Western blot, při němž jako antigen...
|
|
|
Sérologický průkaz lymeské boreliózy
NOVÁKOVÁ, Iveta
Tématem této bakalářské práce je zpracování problematiky lymeské boreliózy. Onemocnění lymeské boreliózy je rozšířeno po celém světě. Původcem jsou různé druhy borelií dle geografického výskytu. Je to onemocnění, jehož přenašečem na našem území je hlavně klíště rodu Ixodes ricinus (v jiných oblastech světa jsou to i jiné druhy). Vyskytují se ve vlhkém prostředí, například v lese nebo ve vysoké trávě. Z toho vyplývá, že více ohroženi jsou lidé, kteří se v těchto lokalitách více vyskytují. Jako jsou příkladně lesníci, ale i děti, které v přírodě tráví více volného času. Lymeskou boreliózu můžeme rozdělit dle pozorovaných příznaků na tři stádia: časně lokalizované, diseminované a pozdní perzistentní stádium. Jako prvotním příznakem boreliózy je nejčastěji uváděna tvorba erythema migrans (EM). EM je vytvoření oválné načervenalé skvrny na kůži, v místě kde bylo přisáté klíště, která může postupem času samovolně vymizet. Jako další příznaky se dají uvést: boreliový lymfocytom, konjuktivitida, neuroborelióza, lymeská karditida a mnoho dalších. Proto pokud jdeme do oblastí, které jsou typická pro výskyt klíšťat, je dobré využít doporučovaných preventivních opatření před přisátím těchto roztočů. K léčbě lymeské boreliózy se využívají antibiotika, které jsou podány pacientovi až po zjištění onemocnění LB. K antibiotické léčbě se používají hlavně: cefalosporiny, makrolidy, tetracykliny nebo peniciliny. Vždycky záleží na tom, v jakém stádiu antibiotika podáváme i na tom, zda pacient má typické klinické příznaky LB. Pro laboratorní diagnostiku lymeské boreliózy se využívají přímé a nepřímé metody. Mezi přímé diagnostické metody se řadí kultivace borélií, hybridizace, imunoelektronová mikroskopie a metoda PCR (polymerázová řetězová reakce) na průkaz boreliové DNA. Dnes je z těchto metod převážně využívána metoda PCR. Z nepřímých diagnostických metod se využívá nepřímé imunofluorescence, Western blot (WB) a ELISA testu (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Pomocí těchto metod se stanovují především specifické protilátky třídy IgM a IgG. Cílem této práce bylo vyšetřit vzorky pacientů na lymeskou boreliózu pomocí metody ELISA testu a Western blotu, otestovat tyto metody a následně zhodnotit jejich výsledky. Jednotlivé vzorky sér, likvorů a punktátů ke zpracování mi byly poskytnuty ve Fakultní nemocnici v Plzni na oddělení sérologie a parazitologie. Před vyšetřením se musí vzorky zředit. K metodě ELISA jsem využila přístroj od firmy Dynex, DSX automatizovaný ELISA systém. Kterým se ve vzorcích stanovují protilátky třídy IgM a IgG. Jde o přístroj, kde během jednoho měření je možné vyšetřit od pacientů až 96 vzorků. Využila jsem i možnost, vyzkoušet si sama ruční stanovení ELISA testu, který se dnes moc nevyužívám, především při větším objemu přijatých vzorků. Pro další vyšetření protilátek IgM a IgG, jsem využila Western blotu a to pomocí komerční sady na ruční stanovení. Celkem jsem vyšetřila v testu ELISA 90 vzorků v třídě IgM, kde vyšly 4 hraniční a 4 pozitivní vzorky od pacientů. Stejných 90 vzorků jsem vyšetřila stejnou metodou i ve třídě IgG, kde vyšly 4 pozitivní vzorky. Dále pak metodou Western blot bylo vyšetřeno 98 vzorků. V třídě IgM vyšlo 5 hraničních a 18 pozitivních vzorků, v třídě IgG oproti tomu vyšlo 5 hraničních a 30 pozitivních vzorků. Poté musí odborný lékař zhodnotit výsledky sérologických testů a klinických příznaků a postupovat tak, aby potvrdil lymeskou boreliózu a vyloučil jiná možná onemocnění.
|
|
|
Analýza rekombinantních klonů apoptotické nukleázy v systému "leaf factory" při koinfiltraci modifikujícími geny
LOMNICKÁ, Anna
TBN1 je nukleáza s protinádorovou aktivitou. Hlavní cíl této práce bylo zjistit, jak je TBN1 a její modifikované formy stabilní v systému ?leaf factory", který je používaný k její produkci, a zda může být tato produkce zvýšena nebo ovlivněna vybranými ?modifikátory", například supresory silencingu, transkripčními faktory, glykosyltransferázami a kinázami. Rostliny Nicotiana benthamiana byly infiltrovány směsí kmenů Agrobacterium tumefaciens, které nesly rostlinný expresní vektor nukleázy a které byly koinfiltrovány s ?modifikujícími" vektory. Nukleázové a proteinové analýzy odhalily, že nukleáza TBN1 wt a její modifikované varianty jsou v použitém systému ?leaf factory" stabilní. Pokud jde o jejich molekulovou hmotnost, byly zaznamenány jen kvatitativní změny. Experimenty ukázaly, že se aktivita a produkce nukleáz zvýšila při koinfitraci se supresorem silencingu a klesla při koexpresi s vybraným transkripčním faktorem. Glykosyltransferázy a kinázy ovlivnily aktivitu a produkci jen zanedbatelně. Experimenty také odhalily, že modifikované varianty TBN1 mají rozdílnou molekulovou hmotnost, což naznačuje, že jednotlivé N-glykosylační domény mají různou délku cukerného řetězce a vliv na nukleázovou aktivitu. Naše data ukazují, že exprese in planta se zdá být vhodná pro produkci pro studium protinádorové aktivity těchto nukleáz.
|
host ::
RSS.