|
|
Analýza aktivního místa rutinosidasy z Aspergillus niger a jeho mutageneze
Šidáková, Anna ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Palyzová, Andrea (oponent)
Rutinosidasy (α-L-rhamnosyl-β-D-glukosidasy) z Aspergillus niger (AnRut) jsou glykosidasy (EC 3.2.1) katalyzující hydrolýzu glykosidové vazby mezi aglykonem a disacharidovým zbytkem rutinosou. Duální substrátová specifita této skupiny enzymů popisuje paralelní aktivitu k substrátům rutinu (nesoucímu disacharidový zbytek rutinosyl) a isokvercitrinu (nesoucímu glukosyl). Aktivní místo AnRut je komplexnější než u ostatních glykosidas a je tvořeno katalytickými aminokyselinami Glu210 a Glu319 v aktivním místě a postranním tunelem - tato netradiční struktura s rozdílnými interakcemi v tunelu a aktivním místě je pravděpodobně důvodem výjimečné substrátové specifity enzymu. Bodovou či vícenásobnou mutací enzymu můžeme modifikovat jeho primární i sekundární strukturu, a tím způsobit i výrazný posun substrátové specifity. Hlavním cílem této práce je analýza tří rozdílných mutantních variant rutinosidasy AnRut, jejich produkce, purifikace a studie vlivu mutací v těchto variantách na substrátovou specifitu enzymů. Všechny varianty byly navrženy na základě molekulárního modelování. Substrátová specifita byla mj. stanovena reakcemi mutantních variant s dosud neprostudovanými substráty. Pomocí HPLC byla také stanovena afinita jednotlivých variant k přirozeným substrátům rutinu a isokvercitrinu. Klíčová slova...
|
|
|
Patogeneze nefrotického syndromu u dětí a prediktory odpovědi na léčbu kortikoidy
Bezdíčka, Martin ; Souček, Ondřej (vedoucí práce) ; Doležel, Zdeněk (oponent) ; Reiterová, Jana (oponent)
Nefrotický syndrom je onemocnění ledvin, jehož podstatou je porucha podocytů. Může vzniknout sekundárně následkem infekce, systémového onemocnění či některých léků, nebo se vyskytne jako náhlá izolovaná primární porucha ledvin. Současný standardní léčebný postup zatěžuje pacienty četnými závažnými nežádoucími účinky. U části nemocných, kteří jsou k úvodní několikatýdenní glukokortikoidní léčbě rezistentní, se daří identifikovat kauzální genetický podklad, u ostatních zůstává příčina neznámá. U pacientů reagujících na úvodní glukokortikoidní léčbu remisí později může dojít k opakovaným relapsům s nutností dlouhodobé glukokortikoidní terapie. Tato práce popisuje vlastní originální výzkumné studie, které se zabývaly možnostmi zlepšení diagnostiky genetických příčin nefrotického syndromu, objevováním molekulární podstaty druhé nejčastější genetické příčiny steroid-rezistentní formy onemocnění (způsobené mutacemi transkripčního faktoru WT1) a hledáním klinických a laboratorních faktorů predikujících rezistenci ke glukokortikoidní léčbě. Kombinací klasického Sangerova sekvenování a moderního sekvenování nové generace (NGS) jsme jako první v kohortě 18 let sbíraných vzorků českých a slovenských dětí s nefrotickým syndromem identifikovali monogenní příčinu u 38 % z nich. Nejprevalentnější byly kauzální...
|
|
|
Příprava mutantního serpinu z klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
EDEROVÁ, Monika
Do P1 místa serpinu Iripin-1 pocházejícího ze slin klíštěte Ixodes ricinus byla pomocí specifických primerů zavedena bodová mutace zaměňující arginin za tryptofan. Protein obsahující tuto mutaci byl exprimován v chemicky kompetentních buňkách Escherichia coli. Následně byl z těchto buněk extrahován a přečištěn pomocí afinitní a rozměrově-vylučovací chromatografie. Aby byl ověřen dopad zavedené bodové mutace, byla otestována schopnost získaného proteinu tvořit kovalentní komplexy s trypsinem.
|
|
|
Role proteinů APOBEC v karcinogenezi indukované HPV
Frolíková, Daniela ; Šmahelová, Jana (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Katalytické polypeptidy podobné enzymu, který upravuje mRNA pro apolipoprotein B (APOBEC) jsou rodina evolučně konzervovaných cytidin deamináz se schopností vazby a modifikace RNA a/nebo ssDNA. APOBEC1-4 zastávají v buňkách řadu funkcí. Zástupci podrodiny APOBEC3 způsobují restrikci cizorodých nukleových kyselin, retrotranspozonů a virů, včetně lidských papilomavirů (HPV), a mohou přispět k vyčištění infekce. Určité HPV jsou označovány jako onkogenní viry, jelikož jsou schopné prostřednictvím onkoproteinů E5, E6 a E7 indukovat imortalizaci a transformaci buněk epitelu. E6 a E7 mohou také navodit transkripci či bránit degradaci některých APOBEC3. Dochází tak k navyšování jejich hladin v buňkách. APOBEC3 působí rovněž jako buněčné mutátory, jelikož mohou během replikace či transkripce katalyzovat deaminace na dočasně vzniklé ssDNA. Deregulace APOBEC3 způsobená onkoproteiny může k mutagenezi přispět. Tato bakalářská práce se zabývá proteiny APOBEC, jejich aktivací a funkcí během HPV indukované karcinogeneze a zejména rozsahem a důsledky APOBEC3 mutací. Klíčová slova: APOBEC, mutageneze, papilomavirus, onkoproteiny, karcinogeneze
|
|
|
Vztah struktury a funkce toxinu RtxA bakterie Kingella kingae.
Růžičková, Eliška ; Osička, Radim (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Bakterie Kingella kingae je pediatricky významná, fakultativně patogenní bakterie. Asymptomaticky kolonizuje orofarynx malých dětí, u nichž je součástí běžné mikroflóry. Pokud však bakterie překročí bariéru respiračního epitelu a začne se šířit do tělních částí, může způsobovat závažná infekční onemocnění. Dnešní pokroky v diagnostických metodách přispěly k zařazení této bakterie mezi významné lidské patogeny a u pacientů dětského věku je K. kingae uváděna jako častá příčina osteoartikulárních infekcí, zejména osteomyelitidy a septické artritidy, bakteriémie a endokarditidy. Klíčovým faktorem virulence této bakterie je cytotoxin RtxA, který patří mezi RTX (Repeats in ToXin) toxiny. Tato rodina toxinů sdílí několik charakteristických rysů: (i) přítomnost N-koncové hydrofobní pórotvorné domény s predikovanými transmembránovými α-helixy, (ii) neaktivní protoxin je aktivován vazbou různých typů mastných kyselin na specifické zbytky lyzinu nacházející se v acylované doméně, (iii) přítomnost nonapeptidových opakujících se sekvencí bohatých na zbytky glycinu a aspartátu, důležitých pro vazbu vápenatých iontů, (iv) přítomnost C-koncového sekrečního signálu, který je rozpoznán sekrečním systémem typu I (T1SS), a (v) způsob sekrece pomocí T1SS. Předchozí studie ukazují, že cytotoxin RtxA proniká do membrán...
|
|
|
Klonování, charakterisace a exprese mutantů lidské serinracemasy
Nováková, Ilona ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Brynda, Jiří (oponent)
AAbbssttrraakktt Lidská serinracemasa (hSR) je cytosolický enzym využívající pyridoxal-5'-fosfát, který je lokalizován v centrální nervové soustavě. Syntetizuje D-serin, aminokyselinu, jež je endogenním koagonistou N-methyl-D-aspartátových (NMDA) receptorů a hraje tak v mozku klíčovou roli v excitační neurotransmisi. Lidská serinracemasa je tudíž slibným cílem při léčbě neurodegenerativních onemocněních spojených s NMDA receptory. Zatím však bylo identifikováno jen málo specifických inhibitorů a krystalová struktura hSR byla vyřešena teprve nedávno. Rozhodli jsme se tedy pomocí náhodné mutageneze určit aminokyselinové zbytky klíčové pro aktivitu enzymu. O zbytku Ser 84 je známé, že se spolu s Lys 56 podílí na katalýze. Poté, co jsme analyzovali mutanta S84G/P111L lidské serinracemasy, který si zachovával schopnost konvertovat L-serin na pyruvát, jsme syntetizovali a charakterizovali mutantní hSR S84G, abychom mohli vyloučit případný vliv mutace P111L. KKllííččoovváá sslloovvaa:: D-serin; Serinracemasa; Enzymy závislé na PLP; Mutageneze; Racemasy
|
|
|
Studium esenciality genu glmM kodujiciho fosfoglukosaminmutasu Streptococcus pneumoniae.
Krupička, Jiří ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Fosfoglukozaminmutáza (GlmM) představuje enzym hrající roli v biosyntéze buněčné stěny bakterií. Hlavním záměrem této diplomové práce bylo zjistit, zda je gen glmM esenciální pro životaschopnost Streptococcus pneumoniae. Za tímto účelem jsme vytvořili merodiploidní kmen obsahující dvě kopie glmM - nativní gen a jeho ektopickou kopii pod kontrolou inducibilního zinkového promotoru. Delecí nativního genu glmM jsme vytvořili mutantní kmen, u něhož jsme analyzovali životaschopnost a fenotyp v médiu s různými koncentracemi zinečnatých iontů, induktoru exprese ektopické kopie glmM. Zjistili jsme, že životaschopnost mutantního kmene je striktně závislá na koncentraci induktoru v médiu a úbytek GlmM se u buněk projevuje výraznými morfologickými defekty a sklonem k lyzi. Prokázali jsme, že následné vyrovnání koncentrace induktoru v médiu na koncentraci odpovídající kontrolnímu vzorku komplementuje projevy úbytku GlmM. Tyto výsledky dokazují esencialitu glmM pro životaschopnost S. pneumoniae. Dále jsme analyzovali, zda je pro funkčnost GlmM esenciální fosforylace na klíčových aminokyselinových zbytcích S99 a S101. Cílenou mutagenezí jsme připravili čtyři varianty plazmidů nesoucích glmM kódující záměny serinových zbytků za alanin nebo kyselinu glutamovou a transformovali je za vzniku čtyř merodiploidních kmenů, v...
|
|
|
Mutagenesis in Danio rerio using CRISPR technology
Nickl, Petr ; Machoň, Ondřej (vedoucí práce) ; Soukup, Vladimír (oponent)
CRISPR/Cas9 systém je nástroj genového inženýrství umožňující sekvenčně specifické editace genomu. Tato technologie byla využita za účelem studia funkce transkripčních faktorů s DNA vazebnou TALE homeodoménou (TALE - three amino acids loop extension) v průběhu vývoje buněk neurální lišty a její derivátů. Hlavními proteiny zájmu této práce jsou Meis1 transkripční faktory, které se v genomu Dania vyskytují v podobě dvou paralogních genů meis1a a meis1b. Funkce jednotlivých proteinů byla analyzována prostřednictvím mutageneze TALE homeodomény za účelem narušení schopnosti transkripčního faktoru vázat DNA a tím narušit regulaci podřízených genů. Tvorba a následná analýza fenotypu mutantních ryby by mohla odhalit potenciální roli Meis1 proteinů v regulaci vývoje buněk neurální lišty, popřípadě poukázat na důležitost homeodomény v regulační funkci těchto proteinů. Současně byl proveden knock-down experiment pomocí morpholino oligonucleotidů k předběžné analýze funkce jednotlivých meis1 genů a odhadu vzájemné funkční komplementarity. Předběžné výsledky poukazují na důležitost Meis1b proteinu v regulaci vývoje buněk neurální lišty a funkční důležitost jeho DNA vazebné domény. Snížení exprese Meis1a ukázalo, že i tento protein má podíl na regulaci kraniofaciálního vývoje, přičemž detailní popis jeho funkce...
|
|
|
Studium esenciality genu glmM kodujiciho fosfoglukosaminmutasu Streptococcus pneumoniae.
Krupička, Jiří ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Fosfoglukozaminmutáza (GlmM) představuje enzym hrající roli v biosyntéze buněčné stěny bakterií. Hlavním záměrem této diplomové práce bylo zjistit, zda je gen glmM esenciální pro životaschopnost Streptococcus pneumoniae. Za tímto účelem jsme vytvořili merodiploidní kmen obsahující dvě kopie glmM - nativní gen a jeho ektopickou kopii pod kontrolou inducibilního zinkového promotoru. Delecí nativního genu glmM jsme vytvořili mutantní kmen, u něhož jsme analyzovali životaschopnost a fenotyp v médiu s různými koncentracemi zinečnatých iontů, induktoru exprese ektopické kopie glmM. Zjistili jsme, že životaschopnost mutantního kmene je striktně závislá na koncentraci induktoru v médiu a úbytek GlmM se u buněk projevuje výraznými morfologickými defekty a sklonem k lyzi. Prokázali jsme, že následné vyrovnání koncentrace induktoru v médiu na koncentraci odpovídající kontrolnímu vzorku komplementuje projevy úbytku GlmM. Tyto výsledky dokazují esencialitu glmM pro životaschopnost S. pneumoniae. Dále jsme analyzovali, zda je pro funkčnost GlmM esenciální fosforylace na klíčových aminokyselinových zbytcích S99 a S101. Cílenou mutagenezí jsme připravili čtyři varianty plazmidů nesoucích glmM kódující záměny serinových zbytků za alanin nebo kyselinu glutamovou a transformovali je za vzniku čtyř merodiploidních kmenů, v...
|
|
|
Úloha variabilních řetězců na rozhraní podjednotek ve formování ATP-vazebné kapsy a funkci P2X4 receptoru
Tvrdoňová, Vendula ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
5 ABSTRAKT Krystalizace P2X4 receptoru (P2X4R) ze zebřičky ("zebra fish", zfP2X4) v uzavřeném a otevřeném stavu odhalila změny v konformacích ektodomény včetně změn v oblasti styčných ploch mezi levou ("left flipper"; LF) a hřbetní ("dorsal fin"; DF) ploutví. Roli těchto struktur ve formování ATP vazebné kapsy a funkci receptoru jsme zkoumali pomocí alaninové skenovací mutageneze úseků LF (D280-N293) a DF (R203-L214) potkaního P2X4R, a s využitím ATP a analogických agonistů 2-(methylthio)adenosin 5'- trifosfátu, adenosin 5'-(γ-thio)trifosfátu, 2'(3'-O-(4-benzoylbenzoyl)adenosin 5'- trifosfátu a α,β-methylenadenosin 5'-trifosfátu. Sníženou citlivost anebo účinnost ATP mělo 15 z 26 vytvořených mutací. Mutace R203A, N204A a N293A byly v podstatě nefunkční, ale jejich funkci bylo možné obnovit ivermektinem, alosterickým modulátorem P2X4R. Mutace I205A, T210A, L214A, P290A, G291A a Y292A měly změněnou odpověď na ATP a na analogické agonisty. Naproti tomu mutace L206A, N208A, D280A, T281A, R282A a H286A nevykazovaly ve srovnání s divokým typem receptoru žádnou změnu v odpovědích na ortosterické agonisty. Tyto pokusy, společně s homologním modelováním ukázaly, že aminokyseliny z první skupiny nacházející se v horní části obou řetězců LF a DF, se podílejí na přesné organizaci ATP-vazebné kapsy a iniciaci převodu...
|
host ::
RSS.