|
|
Factors interacting with bacterial RNA polymerase and their effect on the regulation of transcription initiation
Ramaniuk, Volha
(ČESKÝ) Bakteriální buňka reguluje svou genovou expresi jako odpověď na změny růstových podmínek. RNA polymeráza (RNAP) je stěžejním enzymem pro tento proces, její aktivita je ovlivňována mnoha transkripčními faktory. Ve své práci se zabývám faktory, které se účastní regulace transkripce u grampozitivních baktérií: faktory σ, iniciačními nukleozid trifosfáty (iNTP), HelD, δ a malou RNA Ms1. Hlavní důraz v této práci je kladen na faktory σ z Bacillus subtilis. Faktory σ rozpoznávají specifickou sekvenci DNA promotoru a umožnují navázaní RNAP na tuto sekvenci. Ve svém prvním projektu jsem vytvořila transkripční systém in vitro s purifikovanými alternativními σ faktory z B. subtilis - σB , σD , σH , σI . Pomocí tohoto systému jsem zkoumala efekt změny koncentrace iNTP ([iNTP]) na iniciaci transkripce. Prokázala jsem, že promotory přepisované pomocí alternativních σ faktorů jsou často regulovány [iNTP]. V dalším projektu jsem charakterizovala jeden z nejméně prozkoumaných alternativních faktorů z B. subtilis, I . Identifikovala jsem ~130 genů ovlivněných I , přitom 16 z nich bylo přepisováno přímoI . Prokázala jsem, že se I účastní metabolizmu železa v buňce, a že se váže nejenom na klasické sekvence -35 a -10, ale také na "prodloužené" -35 a -10 elementy. Ve spolupráci s bioinformatickou...
|
|
|
Factors interacting with bacterial RNA polymerase and their effect on the regulation of transcription initiation
Ramaniuk, Volha ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
(ČESKÝ) Bakteriální buňka reguluje svou genovou expresi jako odpověď na změny růstových podmínek. RNA polymeráza (RNAP) je stěžejním enzymem pro tento proces, její aktivita je ovlivňována mnoha transkripčními faktory. Ve své práci se zabývám faktory, které se účastní regulace transkripce u grampozitivních baktérií: faktory σ, iniciačními nukleozid trifosfáty (iNTP), HelD, δ a malou RNA Ms1. Hlavní důraz v této práci je kladen na faktory σ z Bacillus subtilis. Faktory σ rozpoznávají specifickou sekvenci DNA promotoru a umožnují navázaní RNAP na tuto sekvenci. Ve svém prvním projektu jsem vytvořila transkripční systém in vitro s purifikovanými alternativními σ faktory z B. subtilis - σB , σD , σH , σI . Pomocí tohoto systému jsem zkoumala efekt změny koncentrace iNTP ([iNTP]) na iniciaci transkripce. Prokázala jsem, že promotory přepisované pomocí alternativních σ faktorů jsou často regulovány [iNTP]. V dalším projektu jsem charakterizovala jeden z nejméně prozkoumaných alternativních faktorů z B. subtilis, I . Identifikovala jsem ~130 genů ovlivněných I , přitom 16 z nich bylo přepisováno přímoI . Prokázala jsem, že se I účastní metabolizmu železa v buňce, a že se váže nejenom na klasické sekvence -35 a -10, ale také na "prodloužené" -35 a -10 elementy. Ve spolupráci s bioinformatickou...
|
|
|
Účast alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při regulaci exprese genů Corynebacterium glutamicum
Šilar, Radoslav
Abstrakt Regulace transkripce sigma faktory RNA polymerasy s extracytoplazmatickou funkcí (ECF) představuje velmi účinný nástroj pro adaptaci buňky na stresové podmínky vyvolané změnami ve vnějším prostředí. Gram-pozitivní, aerobní bakterie Corynebacterium glutamicum je významným producentem aminokyselin. V genomu C. glutamicum se nachází 7 genů kódujících sigma faktory: primární sigma faktor SigA, sigma faktor SigB označovaný jako primary-like sigma faktor a 5 ECF sigma faktorů (SigC, SigD, SigE, SigH a SigM). Gen sigH, kódující sigma faktor SigH se nachází v těsné blízkosti genu rshA kódujícího jeho anti-sigma faktor. Anti-sigma faktory se reverzibilně vážou k příslušným sigma faktorům, čímž blokují jejich aktivitu. Za stresových podmínek je vazba mezi oběma proteiny rozrušena a uvolněný sigma faktor se může vázat k jádru RNA polymerasy a aktivovat iniciaci transkripce. V práci byla studována především regulace exprese genů kódujících nejvýznamnější ECF sigma faktor SigH a jeho anti-sigma faktor RshA a geny patřící k jeho regulonu. Transkripční analýzou operonu sigH-rshA byly identifikovány čtyři vegetativní promotory genu sigH a jeden SigH-dependentní promotor genu rshA. Účast komplexu SigH-RshA na regulaci exprese genů byla zkoumána s použitím delečního kmene C. glutamicum ΔrshA. Metodou DNA...
|
|
|
Vliv promotorové sekvence na využití NAD+ jako substrátu pro iniciaci transkripce RNA polymerázou
Pinkas, Daniel ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Čepička na 5' konci RNA byla dlouhou dobu považována za výsadu eukaryotních organismů v podobě 7-metylguanosinové čepičky na konci mRNA. To se však změnilo v poměrně nedávné době, kdy byla v bakterii E. coli pomocí metod kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie objevena nová molekula asociovaná s RNA. Touto molekulou se ukázal být nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+ ), připojený na 5' konec některých malých regulačních RNA (sRNA). Pozdější pokusy ukázaly, že je NAD+ na 5' konec RNA přidáno RNA polymerázou ab initio, tedy že NAD+ může sloužit jako substrát pro RNA polymerázu při iniciaci transkripce. Výběr substrátu pro iniciaci transkripce určuje do značné míry promotorová sekvence, přičemž zásadním požadavkem je přítomnost adeninu na pozici +1 (transkripční počátek) kódujícího vlákna DNA. Tato práce se věnuje právě sekvenčním požadavkům na promotor pro iniciaci transkripce pomocí NAD+ . Ty jsou zde zkoumány ve třech fázích transkripce in vitro s holoenzymem RNA polymerázy z bakterie Escherichia coli. Jako templát pro transkripci jsou použity různě modifikované promotory RNA1, Pveg, lac UV5, rrnB P1 a jejich chiméry. Také je zde porovnávána RNA polymeráza z bakterií E. coli a B. subtilis z hlediska výběru substrátu pro iniciaci transkripce. Dále je zde popsána izolace proteinu NudC,...
|
|
|
Indukovatelné promotory a jejich využití pro buněčné manipulace kvasinek
Přibáňová, Gabriela ; Palková, Zdena (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Pro některé buněčné manipulace se dnes využívají promotory, které mohou být indukovány chemickými, nebo určitými fyzikálními faktory. Největší důraz je v této práci kladen na promotory indukovatelné světlem. Jsou dva přístupy, které nám umožňují aktivaci promotoru působením světla. První z nich využívá tzv. "caged molecules", chemických induktorů, jejichž regulační aktivita je "maskovaná" fotolabilní chránící skupinou. Druhý přístup zahrnuje optogenetické systémy, které mohou v buňkách regulovat transkripci. Tyto systémy jsou kódovány v DNA organismu, který tento systém nese, a jako jediný vnější regulační stimul potřebují světlo. Základní součástí optogenetických aparátů jsou fotoreceptory, které pro svou funkci potřebují kofaktor - chromofor. Fotoreceptory se řadí do několika funkčních skupin podle typu chromoforu a způsobu jejich fotoaktivace. Tato práce dává přehled o optogenetických systémech, využitých pro regulaci transkripce z hlediska využitého fotoreceptoru a mechanismu indukce. Stejně tak se zabývá využitím "caged molecules" pro regulaci transkripce. Dále jsou zde jmenovány případy využití těchto systémů v kvasinkách, modelového organismu využívaného ve vědě a pro biotechnologické účely. Na závěr diskutuji určitá omezení, které promotory indukovatelné světlem v některých případech...
|
|
|
Regulatory mechanisms of CD47 surface expression
Jakubec, Martin ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Dibus, Michal (oponent)
Glykoproteín CD47 najdeme na povrchu všech zdravých typů buněk v našem těle. Díky jeho interakci s povrchovým proteinem makrofágů, receptorem SIRPα, má protein CD47 nenahraditelnou úlohu v bezpečném rozeznávání buněk organismu vlastních. Tato interakce má za následek inhibici fagocytózy dané buňky makrofágem. Kromě této interakce hraje CD47 také klíčovou roli ve zprostředkování celé řady esenciálních signálních drah, pro příklad buněčnou adhezi a mobilitu či vápníkovou homeostázu. Míra exprese proteinu CD47 a jeho přítomnost v membráně se mění v závislosti na typu tkáně nebo věku buňky. V buňkách, podstupujících nádorovou transformaci, pozorujeme opětovné zvýšení exprese receptoru CD47, které kromě jiného napomáhá uniknutí imunitnímu dozoru makrofágů, a tedy přežívání těchto buněk. Přirozená regulace genu kódujícího protein CD47 je způsobena regulačními transkripčními faktory, jako jsou například NF-κB či HIF-1. Další z mechanismů regulace exprese CD47 zahrnuje 3'UTR transkriptu, která slouží jako vazbové místo pro regulační proteiny, pro příklad HuR, nebo pro malé RNA. K vlastní regulaci exprese CD47 tak může docházet jak na transkripční, tak na translační úrovni. Pro správné fungování CD47 je však důležitá také jeho správná lokalizace v buňce spolu s agregační topologií proteinů. Důkladné porozumění...
|
|
|
Vlastnosti expresních vektorů pro Corynebacterium glutamicum a jejich využití při studiu faktorů sigma RNA polymerasy
Dvořáková, Pavla ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Cílem práce bylo charakterizovat vybrané expresní vektory pro biotechnologicky významný bakteriální druh, Corynebacterium glutamicum, a testovat možnosti jejich využití při studiu řízení aktivity promotorů faktory sigma RNA polymerasy. Měřením míry exprese modelového genu gfpuv stanovením intenzity fluorescence produkovaného proteinu a použitím analýzy populace buněk C. glutamicum exprimujících gen gfpuv pomocí průtokové cytometrie byly u studovaných vektorů zjištěny odlišné vlastnosti: míra exprese klonovaného genu, bazální hladina exprese bez induktoru, závislost míry exprese na koncentraci induktoru a stupeň homogenity buněk z hlediska exprese genu gfpuv. Pro testování biplasmidového systému pro přiřazení faktoru sigma k vybranému promotoru byl zvolen vektor pEC-XT99A, který sice neměl vysokou účinnost exprese, ale nevykazoval bazální expresi, exprese byla srovnatelná v širší škále koncentrací induktoru IPTG a buněčná populace byla z hlediska exprese modelového genu zcela homogenní. S využitím vektoru pEC-XT99A, který exprimoval jednotlivé geny pro stresové faktory sigma, byl dosud neznámému promotoru Pcg0420 jednoznačně přiřazen faktor σD , který řídil jeho funkci. Další vektor, určený pro izolaci a purifikaci proteinů z C. glutamicum, umožnil expresi genu sigM z C. glutamicum a izolaci proteinu σM...
|
|
|
Účast alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při regulaci exprese genů Corynebacterium glutamicum
Šilar, Radoslav ; Nešvera, Jan (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent) ; Lichá, Irena (oponent)
Abstrakt Regulace transkripce sigma faktory RNA polymerasy s extracytoplazmatickou funkcí (ECF) představuje velmi účinný nástroj pro adaptaci buňky na stresové podmínky vyvolané změnami ve vnějším prostředí. Gram-pozitivní, aerobní bakterie Corynebacterium glutamicum je významným producentem aminokyselin. V genomu C. glutamicum se nachází 7 genů kódujících sigma faktory: primární sigma faktor SigA, sigma faktor SigB označovaný jako primary-like sigma faktor a 5 ECF sigma faktorů (SigC, SigD, SigE, SigH a SigM). Gen sigH, kódující sigma faktor SigH se nachází v těsné blízkosti genu rshA kódujícího jeho anti-sigma faktor. Anti-sigma faktory se reverzibilně vážou k příslušným sigma faktorům, čímž blokují jejich aktivitu. Za stresových podmínek je vazba mezi oběma proteiny rozrušena a uvolněný sigma faktor se může vázat k jádru RNA polymerasy a aktivovat iniciaci transkripce. V práci byla studována především regulace exprese genů kódujících nejvýznamnější ECF sigma faktor SigH a jeho anti-sigma faktor RshA a geny patřící k jeho regulonu. Transkripční analýzou operonu sigH-rshA byly identifikovány čtyři vegetativní promotory genu sigH a jeden SigH-dependentní promotor genu rshA. Účast komplexu SigH-RshA na regulaci exprese genů byla zkoumána s použitím delečního kmene C. glutamicum ΔrshA. Metodou DNA...
|
|
|
Funkce sigma faktorů RNA polymerasy v Corynebacterium glutamicum
Dvořáková, Pavla ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Dvořáček, Lukáš (oponent)
Cílem této práce bylo charakterizovat funkce sigma faktorů bakterie Corynebacterium glutamicum a analyzovat sekvence promotorů rozeznávaných jednotlivými sigma faktory. Faktory sigma (σ) jsou podjednotky RNA polymerasy, které zajišťují rozpoznání sekvence specifické promotorové oblasti genu a umožňují tak zahájit jeho transkripci. Genom C. glutamicum nese geny, které kódují primární sigma faktor σA a šest alternativních sigma faktorů, σB , σC , σD , σE , σH a σM , jejichž exprese se mění v závislosti na růstových podmínkách a v reakci na podněty z okolního prostředí. Regulace exprese genů na úrovni transkripce je jedním z mechanismů adaptace buňky na změny životních podmínek. V závěru práce je sestavena regulační síť sigma faktorů, která je jádrem komplexní regulační sítě řídící všechny děje v buňce C. glutamicum. Klíčová slova: sigma faktor (SF), RNA polymerasa, Corynebacterium glutamicum, transkripce, promotor
|
|
|
Role of promoter in the regulation of alternative splicing
Kozáková, Eva ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Blažek, Dalibor (oponent)
Bylo ukázáno, že až 95 % genů obsahujích více než dva exony, podstupuje alternativní sestřih. Regulace alternativního sestřihu je velmi složitý proces. Většina intronů je odstraněna z pre- mRNA během transkripce a přibývá důkazů, které poukazují na důležitost chromatinových modifikací v regulaci alternativního sestřihu. V této práci ukazujeme, že inhibice histonových deacetyláz (HDACs), která způsobuje zvýšení acetylace histonů a zrychlení elongace Pol II, ovlivňuje alternativní sestřih přibližně 700 genů. Identifikovali jsme HDAC1, jejíž enzymatická aktivita je zodpovědná za změny v alternativním sestřihu. Poté jsme se zaměřili na Brd2 protein, který váže acetylované histony a ovlivňuje alternativní setřih ~ 300 genů. Dále jsme ukázali, že se Brd2 protein váže na promotory genů, které ovlivňuje. Dále jsme zjistili, že deplece histonacetyltransferázy p300 podporuje zahrnutí alternativního EDB exonu fibronektinového genu (FN1) v mRNA. Asociace p300 proteinu s CRE místy v promotoru je zprostředkována interakcí s CREB transkripčním faktorem. Vytvořili jsme sestřihové reportéry pod kontrolou arteficiálních promotorů obsahující CRE místa. Delece i mutace CRE míst v promotoru ovlivnila alternativní sestřih EDB exonu stejně jako deplece p300 proteinu. Poté jsme ukázali, že deplece p300 snižuje acetylaci...
|
host ::
RSS.