|
|
Factors interacting with bacterial RNA polymerase and their effect on the regulation of transcription initiation
Ramaniuk, Volha ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
(ČESKÝ) Bakteriální buňka reguluje svou genovou expresi jako odpověď na změny růstových podmínek. RNA polymeráza (RNAP) je stěžejním enzymem pro tento proces, její aktivita je ovlivňována mnoha transkripčními faktory. Ve své práci se zabývám faktory, které se účastní regulace transkripce u grampozitivních baktérií: faktory σ, iniciačními nukleozid trifosfáty (iNTP), HelD, δ a malou RNA Ms1. Hlavní důraz v této práci je kladen na faktory σ z Bacillus subtilis. Faktory σ rozpoznávají specifickou sekvenci DNA promotoru a umožnují navázaní RNAP na tuto sekvenci. Ve svém prvním projektu jsem vytvořila transkripční systém in vitro s purifikovanými alternativními σ faktory z B. subtilis - σB , σD , σH , σI . Pomocí tohoto systému jsem zkoumala efekt změny koncentrace iNTP ([iNTP]) na iniciaci transkripce. Prokázala jsem, že promotory přepisované pomocí alternativních σ faktorů jsou často regulovány [iNTP]. V dalším projektu jsem charakterizovala jeden z nejméně prozkoumaných alternativních faktorů z B. subtilis, I . Identifikovala jsem ~130 genů ovlivněných I , přitom 16 z nich bylo přepisováno přímoI . Prokázala jsem, že se I účastní metabolizmu železa v buňce, a že se váže nejenom na klasické sekvence -35 a -10, ale také na "prodloužené" -35 a -10 elementy. Ve spolupráci s bioinformatickou...
|
|
|
Bakteriální RNA polymeráza a molekuly ovlivňující její funkci
Jirát Matějčková, Jitka ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Staněk, David (oponent)
RNA polymeráza (RNAP) přepisuje DNA do RNA a je jediným takovým enzymem provádějící transkripci u bakterií. Tento klíčový enzym rozhoduje o odpovědi buňky na vnější i vnitřní signály, rozhoduje o míře transkripce jednotlivých genů a tím reguluje genovou expresi. RNAP ovlivňují nejen vlastní podjednotky, ale i proteinové faktory, malé molekuly či malé RNA (sRNA). Cílem této disertační práce bylo přispět k poznání regulace RNAP a doplnit tak chybějící střípky do tohoto rozsáhlého tématu. Tato práce se zabývá vlivem vybraných proteinů (δ, YdeB, GreA) na citlivost RNAP vůči koncentraci iniciačního nukleosid trifosfátu ([iNTP]) při iniciaci transkripce u Bacillus subtilis. Ukázali jsme, že δ zvyšuje citlivost RNAP k [iNTP] na [iNTP]-senzitivních promotorech, nikoliv však u [iNTP]-nesenzitivních promotorů in vitro ani in vivo. Podjednotka δ je zásadní při soutěži o přežití, neboť umožňuje buňce okamžitě zareagovat na změnu podmínek. Protein YdeB se neváže na RNAP v B. subtilis a zároveň neprokázal žádný viditelný efekt na transkripci in vitro. Zjistili jsme tedy, že proteiny GreA a YdeB na rozdíl od podjednotky δ nejsou schopny ovlivnit citlivost RNAP k [iNTP] u [iNTP]-senzitivních promotorů in vitro. Charakterizovali jsme nově objevenou sRNA u Mycobacterium smegmatis - Ms1, silně produkovanou ve...
|
|
|
Vliv promotorové sekvence na využití NAD+ jako substrátu pro iniciaci transkripce RNA polymerázou
Pinkas, Daniel ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Čepička na 5' konci RNA byla dlouhou dobu považována za výsadu eukaryotních organismů v podobě 7-metylguanosinové čepičky na konci mRNA. To se však změnilo v poměrně nedávné době, kdy byla v bakterii E. coli pomocí metod kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie objevena nová molekula asociovaná s RNA. Touto molekulou se ukázal být nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+ ), připojený na 5' konec některých malých regulačních RNA (sRNA). Pozdější pokusy ukázaly, že je NAD+ na 5' konec RNA přidáno RNA polymerázou ab initio, tedy že NAD+ může sloužit jako substrát pro RNA polymerázu při iniciaci transkripce. Výběr substrátu pro iniciaci transkripce určuje do značné míry promotorová sekvence, přičemž zásadním požadavkem je přítomnost adeninu na pozici +1 (transkripční počátek) kódujícího vlákna DNA. Tato práce se věnuje právě sekvenčním požadavkům na promotor pro iniciaci transkripce pomocí NAD+ . Ty jsou zde zkoumány ve třech fázích transkripce in vitro s holoenzymem RNA polymerázy z bakterie Escherichia coli. Jako templát pro transkripci jsou použity různě modifikované promotory RNA1, Pveg, lac UV5, rrnB P1 a jejich chiméry. Také je zde porovnávána RNA polymeráza z bakterií E. coli a B. subtilis z hlediska výběru substrátu pro iniciaci transkripce. Dále je zde popsána izolace proteinu NudC,...
|
|
|
Regulační síť řízená sigma faktory RNA polymerasy v Corynebacterium glutamicum
Kučera, Tomáš ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Roučová, Kristina (oponent)
Důležitou vlastností bakterií je schopnost přizpůsobit se změně prostředí pomocí regulace exprese genů. Úroveň exprese genů a její načasování závisí hlavně na aktivaci nebo represi daného genu transkripčními regulátory a rozpoznání příslušeného promotoru faktorem sigma, který je podjednotkou RNA polymerázy. Transkripční regulátory společně s faktory sigma a dalšími řídícími elementy tvoří komplexní regulační síť. Regulační síť v Corynebacterium glutamicum je díky sekvenaci genomu a aplikaci řady technik na úrovni genomu jednou z nejlépe prostudovaných v rámci grampozitivních bakterií. Bylo dosaženo mnoha úspěchů v porozumění rolí jednotlivých regulátorů a interakcí mezi regulátory v závislosti na změnách prostředí. Tato práce shrnuje dosud známé poznatky vzájemných vztahů mezi faktory sigma, vlivu faktorů sigma na transkripčními regulátory a jejich společné působení na iniciaci transkripce. V práci je schématicky vytvořena regulační síť faktorů sigma v C. glutamicum a regulační kaskáda v reakci na stresovou situaci. Klíčová slova: faktor sigma (FS), Corynebacterium glutamicum, transkripční regulátor (TR), transkripce, regulace
|
|
|
Development of high-throughput screening assay for the identification of inhibitors targeting influenza A polymerase
Karlukova, Elena ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Virus chřipky způsobuje infekční oněmocnění, postihující 3 až 5 milionů jedinců ročně. V současné době se k lečbě chřipkových infekcí používají dva druhy léčiv: inhibitory neuraminidasy a inhibitory iontového kanálu M2. Vzrůstající počet kmenů resistentních vůči těmto inhibitorům a riziko vzniku nových pandemických kmenů však vytvářejí dosud neuspokojenou potřebu nového typu inhibitorů. RNA-dependentní RNA polymerasa viru chřipky je novým cílem pro vývoj inhibitorů směrovaných proti viru chřipky. Cílem této diplomové práce bylo vyvinout vysokokapacitní testovací metody pro nalezení potenciálních inhibitorů dvou aktivit chřipkové polymerázy - vazby 7-methylguanosinové čepičky hostitelských RNA a jejich enodukleasové štěpění. Pro doménu vázající 7-methylguanosinovou čepičku bylo testování založeno na metodě DIANA (DNA-linked Inhibitor ANtibody Assay), která byla nedávno vyvinuta v laboratoři školitele; testování inhibitorů endonukleasové domény pak bylo založeno na technologii AlphaScreen. Pro potřeby vývoje velkokapacitních testovacích metod byla připravena rekombinantní doména vázající 7-methylguanosinovou čepičku z podjednotky PB2 a N-koncová doména PA podjednotky chřipkové polymerasy, nesoucí endonukleasovou aktivitu. Oba rekombinantní proteiny byly exprimovány s příslušnými afinitními značkami a...
|
|
|
Počítačové modelování komplexů RNA-dependentní RNA polymerázy viru Zika a analog NTP
Ronovský, Michal ; Barvík, Ivan (vedoucí práce) ; Pospíšil, Miroslav (oponent)
Nedávno publikovaná krystalografická struktura RNA-dependentní RNA polymerázy (RdRp) viru Zika umožňuje provádět molekulárně dynamické (MD) simulace tohoto enzymu, které mohou napomoci při racionálním návrhu inhibitorů - potenciálních chemoterapeutik. V teoretické části práce jsou po- psány základní principy MD simulací a mimo jiné i princip výpočtu vazebné volné energie. Poté následuje stručný úvod do struktury nukleových kyselin, proteinů, RNA polymeráz a popis exprese genetické informace. V praktické části práce jsou prezentovány alchymistické transformace ADP na jeho analoga, která byla nedávno vysyntetizována v ÚOCHB AV ČR. Transformace jsou provedeny nej- prve ve vodní obálce a následně v aktivním místě HCV RdRp. Dále je konformace RdRp viru Zika modifikována tak, aby odpovídala konformaci polymerázy viru hepatitidy C a bylo možné do ní vložit nukleové kyseliny. Nakonec jsou provedeny MD simulace analog ADP v aktivním místě polymerázy viru Zika.
|
|
|
Vnitřní terminace transkripce vícepodjednotkových RNA polymeráz
Vojáčková, Jitka ; Sýkora, Michal (vedoucí práce) ; Kuthan, Martin (oponent)
Transkripce je proces, při kterém dochází k přepisu genetické informace z DNA sekvence do RNA kopie pomocí DNA dependentní RNA polymerázy. U bakterií jsou známy dva způsoby terminace transkripce: vnitřní terminace transkripce, která nevyžaduje žádné další přídatné faktory, a terminace závislá na proteinovém faktoru Rho. Vnitřní terminace transkripce je běžná hlavně u bakterií, ale odlišné, i když částečně podobné formy vnitřní terminace transkripce se vyskytují i u eukaryot a archea. Tato práce udává stručný přehled struktury RNA polymerázy a stability elongačního komplexu, popisuje jednotlivé kroky mechanismu vnitřní terminace transkripce u bakterií včetně jejich dnes diskutovaných modelů a udává příklady vnitřní terminace transkripce u eukaryot a archea a jejich porovnání s bakteriálním mechanismem vnitřní terminace transkripce. Klíčová slova: RNA polymeráza, elongační komplex, vnitřní terminace transkripce, vlásenkové RNA struktury
|
|
|
Doménová struktura a funkce primárních faktorů sigma u bakterií
Kálalová, Debora ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Roučová, Kristina (oponent)
Iniciace transkripce patří ke stěžejním krokům genové exprese. Přepis genetické informace z DNA do RNA zajišťuje vícepodjednotkový enzym RNA polymeráza (RNAP). Avšak samotná RNAP není schopná rozpoznat specifický promotor a iniciovat transkripci. K tomuto účelu slouží bakteriím protein zvaný faktor σ, který se na RNAP váže a spolu tvoří holoenzym RNAP. V této práci popisuji mechanismus bakteriální transkripce a dále stavbu, funkci a regulaci faktorů σ. Zaměřuji se hlavně na primární faktory σ u dvou významných modelových druhů, a to u gramnegativní Escherichia coli a grampozitivního Bacillus subtilis. Popisuji je v kontextu s alternativními faktory σ a poukazuji na jejich vzájemné odlišnosti ve struktuře, funkci a regulaci. Klíčová slova: RNA polymeráza, primární faktory σ, transkripce, bakterie, Bacillus subtilis, Escherichia coli
|
|
|
Regulace transkripce faktory sigma u Bacillus subtilis
Benda, Martin ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Seydlová, Gabriela (oponent)
Pro regulaci genové exprese u bakterií je klíčovým enzymem RNA polymeráza (RNAP). RNAP je více-podjednotkový enzym, který pro rozpoznání DNA využívá podjednotky (faktory) σ. Regulace RNAP s hlavním faktorem σ již byla důkladně studována, oproti tomu regulační mechanismy pro RNAP s alternativními faktory σ dosud nebyly systematicky zkoumány. Tato práce se zabývá převážně modelovým organizmem Bacillus subtilis a jeho alternativními faktory σF , σG , σI a σK . Byla studována transkripční iniciace s těmito faktory z hlediska schopnosti transkribovat z různých promotorů, požadavku RNAP na koncentraci iniciačního nukleosidtrifosfátu (iNTP) a interakce RNAP s vybranými proteiny. Pro faktor σF zde byl pomocí transkripcí in vitro objeven promotor regulovaný koncentrací iNTP, u faktoru σI naopak tento regulační mechanismus nalezen nebyl. V případě σG závislé transkripce se nepodařilo regulaci pomocí koncentrace iNTP otestovat, nicméně byl potvrzen v literatuře popsaný pozitivní vliv proteinu YlyA na transkripční aktivitu RNAP obsahující faktor σG ; tento vliv byl nově objeven také pro RNAP s faktorem σF . Dále byla zkoumána možná funkční interakce proteinu HelD s faktorem σK , která však nebyla potvrzena. Konečně pak tato práce přispěla k objasnění vlivu umělých modifikací nukleových bází na transkripci.
|
|
|
Regulation of expression of Ms1, a sRNA from Mycobacterium smegmatis
Páleníková, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
V průběhu růstu musí bakterie čelit různým vlivům prostředí, jako jsou změna teploty, nedostatek živin a jiné. Při adaptaci na nepříznivé podmínky dochází u bakterií k přizpůsobení genové exprese. Jedním typem regulace genové exprese je regulace pomocí malých nekódujících RNA (sRNA). Dobře studovanou bakteriální sRNA je 6S RNA, která se váže na holoenzym RNA polymerázy. Avšak tato RNA byla nalezena jen u některých druhů baterií. Jedním z druhů, které pravděpodobně nemají 6S RNA jsou mykobakterie. Místo toho byla u Mycobacterium smegmatis nalezena jiná malá RNA - Ms1. Ms1 má strukturu podobnou 6S RNA a skutečně byla původně nalezena jako strukturní homolog 6S RNA. Ukázalo se však, že Ms1 se neváže na holoenzym RNA polymerázy, ale váže se na jádro RNA polymerázy. Jedná se proto o malou RNA významně odlišnou od 6S RNA. Tato práce popisuje regulaci exprese Ms1. Z regulační oblasti před genem pro Ms1 byli připraveny promotorové fragmenty různé délky. Tyto fragmenty byly vloženy před reportérový gen lacZ. Aktivita těchto promotorů byla testována v exponenciální, časné a pozdní stacionární fázi růstu a v průběhu stresu. Na základě provedených experimentů byla určena sekvence promotorového jádra a regulační oblasti, do kterých by se mohl vázat transkripční faktor. Aktivita promotoru pro Ms1 se zvýšila při...
|
host ::
RSS.