|
|
Dopravní systémy na bázi syntetických hydrofilních polymerů pro přenos a řízené uvolňování siRNA
Blažková, Jana ; Laga, Richard (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Terapeutika na bázi siRNA představují slibnou naději pro léčbu řady vrozených i získaných onemocnění. Princip metody spočívá v posttranskripčním umlčení patologického genu nebo souboru genů (tzv. RNAi proces), které jsou odpovědné za samotnou příčinu choroby. Přístup tedy vychází z předpokladu možnosti léčby onemocnění přímo v místě vzniku defektu zásahem na molekulární úrovni, čímž se odlišuje od konvenční, tzv. symptomatické terapie, která se zaměřuje pouze na léčbu či potlačení příznaků onemocnění. Navzdory rychle rostoucímu poznání funkce genů a příčiny řady genetických chorob, je expanze siRNA terapeutik limitována vývojem účinných a bezpečných transportních systémů (tzv. vektorů). Abychom zajistili účinnou přepravu siRNA v in-vivo podmínkách, musí vektory dostatečně redukovat velikost siRNA, chránit ji před degradací během transportu a uvolnit v cytoplasmě cílové buňky. Pro tento účel byly vyvinuty sofistikované sytémy virového i nevirového původu, které do jisté míry splňují uvedené požadavky. Tato diplomová práce je zaměřená na přípravu nových dopravních systémů siRNA na bázi syntetických hydrofilních polymerů, coby nevirových vektorů. Pro in vitro testování účinnosti při transportu siRNA byly připraveny dva typy polymerních nosičů a to kladně nabité polymery (polykationty), které elektrostaticky...
|
|
|
Preparation and characterization of diamond-based nanocarriers for transfection of siRNA
Majer, Jan ; Cígler, Petr (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Ačkoliv nanodiamanty byly objeveny a připraveny před desítkami let, až nedávno se začaly využívat v medicínských a biologických oborech, zejména pro doručení léčiv a genetického materiálu do buňky a v biozobrazovacích metodách. Nanodiamanty mohou být modifikovány specifickými, pozitivně nabitými skupinami pro komplexaci s negativně nabitými nukleovými kyselinami. Tyto komplexy následně překonávají extracelulární a intracelulární bariéry a transportují nukleové kyseliny buďto do cytosolu nebo do jádra. Díky fluorescenčním centrům dusík-vakance, které mohou být v nanodiamantech vytvořeny, vykazují nanodiamanty vynikající optické vlastnosti pro sledování transfekce, protože emitují stabilní fluorescenci bez "photoblinkingu" a "photobleachingu". Tato práce shrnuje vlastnosti, syntézu, modifikace nanodiamantů a dalších vybraných nanočástic a jejich in vitro aplikace. Porovnává také jejich cytotoxicitu a efektivitu genového "knockdownu".
|
|
|
Design siRNA a vliv modifikací na jejich stabilitu a účinnost
Kuldanová, Kateřina ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Návrh krátkých interferujících RNA (siRNA) je základním krokem k úspěšné RNA interferenci (RNAi). Navrhnout vhodný siRNA duplex ale není zcela triviální, neboť existuje několik problematických oblastí, jako jsou například stabilita siRNA duplexů v přítomnosti nukleáz, účinnost eliminace cílové mRNA, sekvenčně specifická eliminace necílových mRNA, cytotoxicita a imunogenicita, ovlivňujících funkčnost siRNA duplexů a tedy i jejich využitelnost v medicíně a dalších oborech. Porozumění principům fungování siRNA duplexů při RNAi je nezbytným krokem k vyřešení výše uvedených překážek na cestě k účinným léčivům. Prostředkem optimalizace popsaných vlastností je úprava návrhu siRNA duplexů pomocí různých modifikací. Modifikovat lze fosfodiesterovou kostru, báze i ribózu. V každé z těchto skupin jsou známy modifikace, které mají na siRNA duplexy a následnou RNA interferenci pozitivní vliv. Tato práce předkládá dosavadní poznatky o několika nejznámějších modifikacích, jako jsou thiofosfátová substituce, 2′-deoxy-2′-fluoronukleotidy, 2′-O-methyl ribonukleotidy a LNA nukleotidy, a o větším počtu méně známých modifikací, jako jsou boranofosfátová substituce, 4′-thioribonukleotidy, 2′-O-methyl-dithiofosfátová modifikace a mnoho dalších, které ovlivňují vlastnosti siRNA duplexu.
|
|
|
Polymerní systémy pro dopravu siRNA
Blažková, Jana ; Pechar, Michal (vedoucí práce) ; Šťovíček, Vratislav (oponent)
Proces RNA interference (RNAi) je přirozený jev, při kterém dochází prostřednictvím malých dvouřetězcových RNA molekul (dsRNA) k posttranskripční regulaci exprese genů. "Small interfering RNA" (siRNA) je malá dsRNA, kterou můžeme využít pro cílené umlčování genů, jakožto alternativní terapeutickou léčbu geneticky podmíněných onemocnění. Pro in vivo aplikaci je nutné siRNA ochránit před degradací, abychom zajistili její efektivní dopravení do cílových buněk pomocí sofistikovaných vektorů. Tato práce je zaměřená především na na popis nevirových vektorů na bázi kladně nabitých polymerů, tvořících s siRNA polyelektrolytové komplexy (polyplexy), a povrchově modifikujících hydrofilních polymerů zajišťující ochranu vektoru během transportu v krvi.
|
|
|
Metylace DNA řízená malými RNA u Arabidopsis thaliana
Motylová, Šárka ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
Rozdílná transkripční aktivita různých oblastí genomu je zajišťována epigenetickými modifikacemi, mezi které patří metylace DNA, úprava N-koncových aminokyselin histonů a změny v zastoupení histonových variant. RNA interference je regulační proces, při kterém dochází prostřednictvím malých RNA odvozených z exogenních či endogenních sekvencí k posttrankripčnímu nebo transkripčnímu umlčení těchto sekvencí. 24-nukleotidové siRNA, tvořící část malých RNA, řídí de novo metylaci a spoluúčastní se udržování metylace DNA (RNA-directed DNA methylation; RdDM), která se podílí na transkripčním umlčení heterochromatinu a transponovatelných elementů, vyskytujících se u rostlin ve velkém množství. Pro krytosemenné je také charakteristická přítomnost RNA polymeráz IV a V účastnících se v této dráze, které byly poprvé objeveny v genomu Arabidopsis thaliana, jež se stala hlavní modelovou rostlinou i pro studium RdDM. Polymeráza IV přepisuje prekurzory siRNA; siRNA jsou následně asociované s AGO4 proteiny a navádějí metylační enzymy na cílové sekvence prostřednictvím komplementarity s transkripty polymerázy V.
|
|
|
Na velikosti záleží - biogeneze a funkce siRNA u Arabidopsis
Přibylová, Adéla ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Honys, David (oponent)
RNA interference (RNAi) hraje důležitou roli v různých biologických procesech zahrnujících regulaci genů a transposonů, vývoje částí rostlinného těla, reakci na stres, remodelaci chromatinu a antivirovou obranu. Základem RNAi jsou krátké molekuly RNA (malé RNA, sRNA), které rostliny produkují ve velikostním rozmezí 21 - 24 nukleotidů (nt) a které jsou schopny na základě komplementarity rozpoznat cílové molekuly RNAi. Malé RNA lze rozdělit na dva základní typy: microRNA (miRNA) a malé interferující RNA (siRNA). K tvorbě a aktivitě malých RNA jsou potřeba proteiny z několika genových rodin: DICER-LIKE (DCL) vytváří malé RNA z dvouvláknového RNA prekurzoru, který je často tvořen aktivitou RNA dependentní RNA polymerázy (RDR). Proteiny ARGONAUTE (AGO) s těmito malými RNA asociují a vytváří tak RNA-indukovaný umlčující komplex (RISC), který hraje klíčovou roli v rozpoznání cílové molekuly a ve výkonné fázi RNAi. Na to, jakou dráhou se bude RISC komplex ubírat, má vliv velikost, struktura i biogeneze malé RNA. RNAi působí jednak na post-transkripční úrovni (PTGS), formou degradace cílové RNA či blokováním translace, a jednak na transkripční úrovni (TGS), kde sRNA zprostředkovávají metylaci histonů a DNA.
|
|
|
Processing of different substrates by mammalian Dicer
Faltýnková, Jana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Dráhy malých RNA představují u eukaryotických organismů sekvenčně specifické mechanismy regulující genovou expresi nebo zprostředkující antivirovou obranu. Společnou vlastností těchto drah jsou ~20 až 30nukleotidové malé RNA, které fungují jako sekvenčně specifičtí průvodci. Dráhy malých RNA se od sebe a mezi různými organismy liší v rolích, biogenezi malých RNA a způsobu regulace cílových molekul. U savců jsou 3 klíčové dráhy malých RNA: RNA interference, mikroRNA (miRNA) dráha a PIWI-interagující RNA (piRNA) dráha. Tvoření malých RNA pro RNA interferenci a miRNA dráhu je závislé na proteinu Dicer, který štěpí malé interferující RNA (siRNA) a miRNA z jejich prekurzorů: dlouhých dvouřetězcových RNA a vlásenek. Tato bakalářská práce poskytuje vhled do struktury a funkce savčího Diceru a do rozdílů ve zpracování pre-miRNA a prekurzorů siRNA.
|
|
| |
|
|
RNA interference u rostlin
Čermák, Vojtěch ; Kulich, Ivan (oponent) ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce)
RNA interference je jedním z dějů, které umožňují v buňkách regulovat aktivitu genů. Tento proces je většinou spouštěn přítomností dvoušroubovicové RNA v buňce. Z takovéto RNA mohou být vyštěpovány duplexy malých RNA, většinou o délce 20-25 nukleotidů, za pomoci proteinu zvaného Dicer. Jednovláknové malé RNA uvolněné z těchto duplexů jsou základním kamenem RNA interference a lze je třídit do několika skupin na základě jejich biogeneze. U rostlin se setkáváme s miRNA a siRNA. Malé RNA asociují s proteinem zvaným Argonaut a navádějí jej na základě sekvenční komplementarity k cílové molekule. Argonaut může fungovat buďto sám nebo v komplexu s jinými proteiny. V závislosti na charakteru proteinů účastnících se tohoto děje spouští malé RNA různorodé procesy, které mohou vést ke štěpení mRNA (proces, na který stačí samotný komplex Argonaut a malá RNA), blokování translace nebo modifikacím chromatinu. S RNA interferencí se lze setkat u většiny Eukaryot, kde hraje roli ve vývoji organismů, jejich reakci na stres, úpravách chromatinu a také v obraně proti virům. U rostlin se setkáváme s rozmanitou škálou mechanismů, kterými může RNAi fungovat a kterým začínáme teprve postupně rozumět a doceňovat jejich význam.
|
|
|
Analysis of short Argonaute isoforms from mouse oocytes
Jankele, Radek ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Analýza kratkých isoforem proteinů Argonaůt z mýsích oocýtů Abstrakt: Proteiny z rodiný Argonaůtů, řízené malými molekůlami RNA, představůjí konzervované jádro mechanismů ůmlčování RNA (RNA silencing). Týto mechanismý potlačůjí prodůkci virů, šíření mobilní DNA, a regůlůjí genovoů expresi na základě sekvenční informace nesené asociovanou RNA. V somatických bůňkách savců je dominantním mechanismem regůlační microRNA (miRNA) dráha. Malé miRNA ovlivňůjí expresi většiný savčích genů. Argonaute proteiny inhibůjí translaci a indůkůjí deadenylaci mRNA s částečnoů homologií k navázané miRNA. Deadenylace obvykle výústí degradaci mRNA. Těmito mechanismý miRNA dráha citlivě kontrolůje hladiný prodůkovaných proteinů. Na rozdíl od příbůzného mechanismů RNA interference (RNAi) výůžívajícího katalyticky aktivní proteiny Argonaute schopné rozštěpit komplementárních molekuly RNA, miRNA ůmlčování je závislé na celé řadě dalších faktorů. Role miRNA regulace v komplexních biologických procesech od organogeneze, přes krvetvorbů až po rakovinu je dobře doložená. Mýší oocýtý postrádající kanonické miRNA jsoů překvapivě schopné oplození a úspěšně projdoů preimplantačním vývojem. Ani nejčetnější oocýtární miRNA však nejsou sto efektivně ůmlčet cílové gený, přestože příbůzný mechanismůs RNAi, sdílející s miRNA mechanismem klíčové...
|
host ::
RSS.