|
|
Charakterizace PHA produkujících buněk pomocí pokročilých mikroskopických a cytometrických technik
Dlouhá, Karolína ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem této bakalářské práce je zdokumentovat produkci polyhydroxyalkanoátů u vybraných bakteriálních kmenů, kterými byly Pseudomonas thermotolerans, Chelatococcus daeguensis, Tepidiphilus thermophilus a Chelatococcus thermostellatus. U mikroorganismů Tepidiphilus thermophilus a Pseudomonas thermotolerans zatím nebyla produkce PHA pospána a u bakterií rodu Chelatococcus, které byly v této práci analyzovány, nebyla produkce zdokumentována pomocí elektronové mikroskopie. V této práci byly vybraní producenti analyzováni nejdříve pomocí průtokové cytometrie s použitím fluorescenčních sond BODIPY a Nilská červeň. Vybraní producenti, u kterých se produkce potvrdila, byly analyzováni dalšími metodami, kterými byly fluorescenční mikroskopie, cryo-skenovací elektronové mikroskopie a na závěr transmisní elektronová mikroskopie. U bakteriální kultury Pseudomonas thermotolerans se produkce PHA nepotvrdila již při první analýze pomocí průtokového cytometru. U ostatních mikroorganismů byla produkce potvrzena. Bakterie rodu Chelatococcus se jasně prokázaly jako lepší producenti. Bakteriální buňky Tepidiphilus thermophilus produkovaly menší granule a v menším množství.
|
|
|
Metody identifikace PHA produkujících bakterií
Skřivanová, Veronika ; Turková, Kristýna (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá testováním, optimalizací a porovnáním metod vhodných pro identifikaci bakterií produkujících polyhydroxyalkanoáty. V rámci práce byly využity metody kultivační a mikroskopické, kde byly bakteriální buňky barveny lipofilními barvivy Nilská červeň a Sudánová čerň. Dále byla využita průtoková cytometrie a metody spektroskopické, a to Ramanova spektroskopie a infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací a také metody molekulárně biologické, kde byla analyzována přítomnost genu kódujícího PHA syntázu (phaC) pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). PCR test se skládá ze dvou reakcí, v první reakci je phaC gen amplifikován společně s 16S rRNA oblastí společnou pro všechny bakterie (multiplexní PCR). Druhá reakce je pak specifická pro PHA syntázu katalyzující biosyntézu mcl-PHA. Podle výsledků práce je při identifikaci PHA produkujících kmenů za účelem eliminace falešně pozitivních výsledků metod analyzujících genotyp a falešně negativních výsledků metod zkoumající fenotyp kombinovat oba přístupy. Jako velice perspektivní se jeví kombinace PCR pro stanovení přítomnosti phaC genu a následné analýzy přítomnosti PHA v bakteriálních buňkách. K tomuto účelu se nám nejlépe osvědčila Ramanova mikrospektroskopie, která je schopna zachytit i nízký obsah PHA v buňkách a zároveň nehrozí záměna PHA za jiné lipidické látky. Výsledky práce poskytují přehled testovaných metod, jejich výhody a nevýhody a také porovnání různých kritérií, dle kterých je možné vybrat metodu identifikace v závislosti na nastavených požadavcích.
|
|
|
Analýza diferenciálního rozpočtu leukocytů v periferní krvi různými diagnostickými metodami
Pavlík, Jan ; Provazník, Ivo (oponent) ; Hrubeš, Jan (vedoucí práce)
V současné době je standardizace morfologického vyšetření cytologických preparátů velice obtížné. Digitalizace obrazu a rozvoj výpočetní technologie umožňuje najít vhodné řešení k efektivnímu zpracování cytologických vzorků. Firma Cellavision vyvinula ve spolupráci s předními morfology přístroj Cellavision DM96, který využívá digitalizaci obrazu krevních buněk pro jejich morfologickou diagnostiku a následnou archivaci. Je důležité se na tento systém zaměřit a prověřit jeho využití v klinické praxi. Výsledky získané dvěma různými metodami byly statisticky zpracovány a vyhodnoceny.
|
|
|
Large Extracellular Vesicles in Cell Culture and Blood: Role in Prion Transmission and Detection by Flow Cytometry
Soukup, Jakub
Priony (PrP) jsou hlavní příčinou neurodegenerativních onemocnění jako je ovčí klusavka, bovinní spongiformní encefalopatie, chronické strádání jelenovité zvěře a lidská Creutzdfeld- Jacobova choroba. Přestože se buněčný PrP (PrPC ) účastní mnoha buněčných procesů, jeho přesná funkce není dosud známá. Onemocnění vzniká akumulací patologické formy PrP (PrPTSE ), která vzniká přímým kontaktem PrPTSE a PrPC . PrP je ukotvený v membráně pomocní GPI a může být přenášen mezi buňkami kontaktem, tzv. "tunnelling nanotubes" nebo extracelulárními vezikuly (EV). Frakce EV se dělí na exosomy, mikrovezikuly a apoptotická tělíska rozdílnou biogenezí. PrPTSE se nachází v exosomech a mikrovezikulech, ale tyto frakce EV nikdy nebyly mezi sebou porovnány. Prvním cílem dizertační práce je porovnat obsah PrP, prion konvertující aktivitu a infektivitu v těchto frakcích EV na CAD5 a N2a-PK1 buněčných modelech infekce. Centrifugací jsme izolovali frakci velkých EV (20 000× g) a malých EV (110 000× g) z kondiciovaného média. EV jsme charakterizovali pomocí kryo-elektronové mikroskopie a western blotem s markery Alix, TSG-101, CD63, CD9 a HSP70. Kontaminace z jiných buněčných kompartmentů byla ověřena kalnexinem. Frakce EV se mezi sebou lišili obsahem β-1 integrinu. Malé EV mají sníženou a velké EV mají zvýšenou hladinu...
|
|
|
Diverzita vrbovek (rod Epilobium) a metody studia jejich hybridizace
Kuchyňková, Lenka ; Kaplan, Zdeněk (vedoucí práce) ; Šemberová, Kristýna (oponent)
Vrbovka (Epilobium) patří mezi rody, na jehož evoluci se významně podílí mezidruhová hybridizace. Tento proces sice generuje evoluční novinky a může vést ke speciaci, může však mít za následek i genetickou erozi a extinkci. Tato práce se věnuje především zástupcům rodu Epilobium, které jsou mezidruhovou hybridizací potenciálně ohroženi. Z české květeny je to především skupina vzácných horských vrbovek zahrnující E. nutans, E. alsinifolium a E. anagallidifolium. Kromě časté mezidruhové hybridizace pak komplikuje situaci v této skupině i minuciéznost rozlišovacích znaků. Rešerše také shrnuje dostupné metody, které mohou být ke studiu mezidruhové hybridizace využity v rámci navazující diplomové práce.
|
|
|
Evoluce velikosti genomu u streptofytních řas rodu Zygnema a souvislosti s ekologií jednotlivých druhů
Lukeš, Jiří ; Čertnerová, Dora (vedoucí práce) ; Lučanová, Magdalena (oponent)
Velikost genomu je znakem, který napříč eukaryotickou diverzitou variuje 64 000 ×. Tato variabilita však nemá žádnou spojitost s komplexitou organismů. Avšak samotné množství DNA souvisí s řadou fenotypických znaků organismů. Konkrétně studie prováděné na rostlinách hledají možné souvislosti velikosti genomu s ekologickými nároky jednotlivých druhů. Obdobné studie u mikroskopických řas však nejsou hojné a často se potýkají s řadou metodologických problémů. Tato práce představuje data o velikosti genomu získaná pomocí metody průtokové cytometrie pro 129 zástupců rodu Zygnema spadajících do 68 evolučních linií. Měření odhalila rozmezí velikosti genomu v rámci tohoto rodu od 0,22 do 5,06 pg. Zároveň bylo popsáno několik linií vykazujících značnou variabilitu ve velikosti genomu, která v mnohých případech napovídá o možných polyploidizacích u tohoto rodu. Identifikace identického poměru GC páru bází u vybraných domnělých polyploidních a monoploidních zástupců podpořila hypotézu o polyploidizaci. Rovněž byla ověřena platnost obecné korelace velikosti buněk a velikosti genomu v rámci této skupiny. Díky známým fylogenetickým vztahům mezi měřenými liniemi byla rekonstruována evoluce velikosti genomu v rodě Zygnema. Dále byly analyzovány možné vztahy mezi velikostí genomu a ekologickými preferencemi...
|
|
|
Průtoková cytometrie v biosystematice hmyzu
Javůrková, Jaroslava ; Šípek, Petr (vedoucí práce) ; Sadílek, David (oponent)
Velikost genomu neboli obsah DNA v buňkách je vyjadřována pomocí tzv. C-hodnoty, tj. hmotnosti DNA v jednotkách pg, respektive jako 2C-hodnoty pro obsah DNA v somatických buňkách diploidních organismů. Jednoduchou metodou využívanou mimo jiné pro zjištění velikosti genomu je průtoková cytometrie. Tato metoda se již tradičně těší veliké oblibě zejména mezi botaniky, kde je využívaná především při taxonomických a populačních studiích či pro zjišťování ploidie jednotlivých linií. Naopak velikost genomu u živočichů, respektive u hmyzu je relativně málo studována. Z více než milionu popsaných hmyzích druhů je velikost genomu známá u pouhých stovek z nich. Tato práce poskytuje informace o velikosti genomu osmdesáti osmi druhů hmyzu z vybraných řádů skupiny Polyneoptera - čtyřech druhů škvorů (Dermaptera), čtyřech druhů snovatek (Embioptera), čtrnácti druhů kudlanek (Mantodea), sedmnácti druhů strašilek (Phasmatodea), čtyřiceti šesti druhů rovnokřídlých (Orthoptera), jednoho druhu termita (Isoptera, Blattodea) a dvou druhů pošvatek (Plecoptera). Zjištěné absolutní velikosti genomů a míry jejich rozsahů byly porovnány v rámci jednotlivých řádů, v rámci skupiny Polyneoptera a srovnány s velikostmi genomů dalších taxonů hmyzu. Výsledkem práce je mimo jiné i doposud největší změřený genom u hmyzu - saranče...
|
|
|
Vliv časného postnatálního podávání probiotické bakterie Escherichia coli O83:K24:H31 na proporční a funkční vlastnosti vybraných buněčných populací
Věcek, Jan ; Hrdý, Jiří (vedoucí práce) ; Funda, David (oponent)
Hygienická hypotéza naznačuje, že expozice mikroorganismům v časném období po porodu je zásadní pro správný vývoj imunitního systému a může předejít vzniku alergií a autoimunitních onemocnění. Probiotika, živé mikroorganismy s pozitivním efektem na lidské zdraví, můžou být bezpečným způsobem jak podpořit správný vývoj imunitního systému. Bylo prokázáno, že časné postnatální podání probiotického kmene Escherichia coli O83:K24:H31 (EcO83) snižuje incidenci alergií v pozdějším věku. S cílem identifikovat imunomodulační vlastnosti EcO83 jsme provedli bioinformatickou analýzu jejího genomu a porovnali jsme ho s genomy dvou dalších kmenů, E. coli Nissle a E. coli K12. Identifikovali jsme unikátní geny v genomu EcO83, které se podílejí na metabolismu propionátu a galaktózy. Stejně tak jsme našli geny zvyšující schopnost EcO83 přežít v gastrointestinálním traktu. Dále jsme EcO83 transformovali geny pro luciferázu. Pomocí detekce bioluminescence jsme zjistili, že EcO83 dokáže efektivně kolonizovat gastrointestinální trakt novorozené myši, ale nikoli dospělého jedince. Další analýza myší kolonizovaných EcO83 ukázala, že podání EcO83 zvyšuje expresi genů podílejících se na formaci těsných spojů v ileu. Podání EcO83 zvyšuje taktéž přítomnost kostimulačních molekul na povrchu dendritických buněk v...
|
|
|
Large Extracellular Vesicles in Cell Culture and Blood: Role in Prion Transmission and Detection by Flow Cytometry
Soukup, Jakub ; Holada, Karel (vedoucí práce) ; Šebestová Janoušková, Olga (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Priony (PrP) jsou hlavní příčinou neurodegenerativních onemocnění jako je ovčí klusavka, bovinní spongiformní encefalopatie, chronické strádání jelenovité zvěře a lidská Creutzdfeld- Jacobova choroba. Přestože se buněčný PrP (PrPC ) účastní mnoha buněčných procesů, jeho přesná funkce není dosud známá. Onemocnění vzniká akumulací patologické formy PrP (PrPTSE ), která vzniká přímým kontaktem PrPTSE a PrPC . PrP je ukotvený v membráně pomocní GPI a může být přenášen mezi buňkami kontaktem, tzv. "tunnelling nanotubes" nebo extracelulárními vezikuly (EV). Frakce EV se dělí na exosomy, mikrovezikuly a apoptotická tělíska rozdílnou biogenezí. PrPTSE se nachází v exosomech a mikrovezikulech, ale tyto frakce EV nikdy nebyly mezi sebou porovnány. Prvním cílem dizertační práce je porovnat obsah PrP, prion konvertující aktivitu a infektivitu v těchto frakcích EV na CAD5 a N2a-PK1 buněčných modelech infekce. Centrifugací jsme izolovali frakci velkých EV (20 000× g) a malých EV (110 000× g) z kondiciovaného média. EV jsme charakterizovali pomocí kryo-elektronové mikroskopie a western blotem s markery Alix, TSG-101, CD63, CD9 a HSP70. Kontaminace z jiných buněčných kompartmentů byla ověřena kalnexinem. Frakce EV se mezi sebou lišili obsahem β-1 integrinu. Malé EV mají sníženou a velké EV mají zvýšenou hladinu...
|
|
|
Zapojení polyhydroxyalkanoátů do stresové odpovědi termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans
Berger, Matyáš ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Slaninová, Eva (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce je zaměřena na zkoumání vlivu rozdílných stresových faktorů na bakterii Schlegelella thermodepolymerans, která je schopná produkce polyhydroxyalkanoátů. V tomto případě ve formě poly(3-hydroxybutyrátu). Vybranými stresovými faktory byly teplotní šok, opakované zmrazení a rozmrazení. Posledním stresovým faktorem byl osmotický stres, vyvolaný roztoky chloridu sodného o různé koncentraci. V teoretické části byly charakterizovány polyhydroxyalkanoáty, termofilní organismy, mechanismy jednotlivých stresů a metody analýzy polyhydroxyalkanoátů. V experimentální části byly porovnány dva kmeny termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans, a to M 15344 a DSM 15344. Byla porovnána odolnost vůči stresu obou kmenů, měřením viability za pomocí metody průtokové cytometrie. Během měření byl sledován nárůst optické hustoty, a za pomocí GC-FID byl stanoven obsah P(3HB) v biomase. Morfologické změny způsobené stresy byly pozorovány pomocí metod elektronové mikroskopie Cryo-SEM a STEM. Kmen DSM 15344 vykazoval lepší růst a produkci P(3HB), než kmen M 15344, který naopak lépe odolával vystavenému stresu.
|
host ::
RSS.