|
|
Regulace transportu NMDA receptorů v savčích neuronech
Hemelíková, Katarína ; Horák, Martin (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Valeš, Karel (oponent)
N-methyl-D-aspartátové (NMDA) receptory řadíme mezi ionotropní glutamátové receptory ovlivňující excitační synaptický přenos a synaptickou plasticitu v centrálním nervovém systému (CNS) savců. Aktivace NMDA receptorů hraje klíčovou roli ve vývoji mozku nebo při formování paměti. Abnormální regulace NMDA receptorů je jedna z hlavních příčin vzniku různých neurologických a psychiatrických onemocnění. NMDA receptory vytvářejí heterotetramerní komplexy složené z GluN1, GluN2(A-D) a/nebo GluN3(A a B) podjednotek. Povrchová exprese NMDA receptorů je regulovaná na mnoha úrovních, včetně zpracování a kontroly v endoplazmatickém retikulu (ER), intracelulárního transportu přes Golgiho aparát (GA), internalizace, recyklace a následné degradace. NMDA receptory jsou na úrovni časného transportu regulovány: volnou dostupností GluN podjednotek v ER, přítomností ER- retenčního a exportního signálu a posttranslačními modifikacemi, včetně fosforylace a palmitoylace. Avšak role N-glykosylace v regulaci transportu NMDA receptorů dosud nebyla plně objasněna. Cílem této práce proto bylo objasnění mechanismů regulace povrchové exprese a funkčních vlastností NMDA receptorů. V předložené práci jsme použili kombinaci nejmodernějších metod z oblasti molekulární biologie, mikroskopie, biochemie a elektrofyziologie. Rovněž...
|
|
|
Glutamátové receptory a kvalitativní kontrola v endoplazmatickém retikulu
Tachezy, Ruth ; Horák, Martin (vedoucí práce) ; Adámek, Pavel (oponent)
Kvalitativní kontrola (QC) je soubor procesů, které se účastní biogeneze a výstavby proteinů. Cílem této práce je tyto procesy detailně popsat. V buňce probíhá QC na mnoha úrovních. Popisuji QC endoplazmatického retikula (ER) a s ní propojenou QC cytosolickou. QCER zahrnuje více druhů translokace do lumen ER, glykosylaci, formování disulfidických můstků pomocí protein disulfid izomerázy (PDI), chaperony účastnící se těchto procesů a ER-asociovanou degradační dráhu, která chybně sbalené proteiny retranslokuje zpět do cytoplasmy, kde jsou následně degradovány v proteosomu. QC cytosolu je s ERQC propojená, neboť proteiny se translatují v cytosolu a jsou poté různými druhy drah přenášeny na nebo přes membránu ER. S cytosolickou degradací proteinů v proteasomu souvisí ubikvitinace proteinů a účastní se jí také cytosolické chaperony a další buněčné organely, jako například agresomy, juxtanukleární kompartmenty a depozita nerozpustných proteinů. S kvalitativní kontrolou a správným sbalením proteinů v ER je rovněž spojena vápníková rovnováha. Například chybné sbalení glutamátových receptorů vede k některým neurodegenerativním onemocněním. Klíčová slova: kvalitativní kontrola, endoplasmatické retikulum, ERAD, ERQC, glutamátový receptor, protein, glykosylace, posttranslační modifikace, degradace, proteasom,...
|
|
|
Functional and structural study of thermally activated TRP ion channels: The role evolutionarily conserved motifs in the TRPA1 modulation
Kádková, Anna ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent) ; Obšilová, Veronika (oponent)
Ankyrinový receptor TRPA1 je iontový kanál exprimovaný převážně na primárních aferentních senzorických neuronech, kde působí jako polymodální senzor pro bolestivé a dráždivé podněty. Kromě chemických látek (např. isothiokyanáty, skořicový aldehyd a jeho deriváty, akrolein, menthol) může být aktivován chladem, depolarizací membránového potenciálu nebo vápenatými ionty z intracelulární strany. Iontový kanál TRPA1 je homotetramerem podjednotek, jež jsou topologicky uspořádány do transmembránové oblasti a cytoplazmaticky orientovaných N- a C-konců. Transmembránová oblast je tvořena šesti alfa-helixy propojenými intra- a extracelulárními kličkami. N-konec receptoru se vyznačuje přítomností 16 až 17 ankyrinových repetic (AR), zatímco C-konec je výrazně kratší a má převážně helikální strukturu. Přesná struktura TRPA1 byla částečně rozřešena roku 2015 pomocí kryo-elektronové mikroskopie, avšak funkční úloha jednotlivých oblastí v polymodální aktivaci receptoru není prozatím plně objasněna. Předkládaná disertační práce se zabývá úlohou mezidruhově konzervovaných strukturních a sekvenčních motivů v cytoplazmatických koncích a v S4-S5 oblasti TRPA1 v napěťové a chemické citlivosti receptoru. Pomocí homologního modelování, molekulárně-dynamických simulací, bodové mutageneze a elektrofyziologických technik bylo...
|
|
|
Role glykosylace ionotropních glutamátových receptorů v savčích neuronech
Danačíková, Šárka ; Horák, Martin (vedoucí práce) ; Kriška, Ján (oponent)
Glutamát je nejvíce zastoupeným excitačním neuropřenašečem v centrální nervové soustavě savců. Existují dva typy glutamátových receptorů, ionotropní a metabotropní, které se nacházejí v excitačních synapsích savců. Práce je zaměřena na ionotropní glutamátové receptory, které mají klíčovou roli v procesech učení a paměti. Hlavní subtypy ionotropních glutamátových receptorů byly označeny podle svých specifických agonistů: α-amino-3- hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionové kyseliny (AMPA), N-methyl-D-aspartátu (NMDA) a kainátu. Všechny typy ionotropních glutamátových receptorů, které se skládají do formy tetramerů, obsahují mnoho glykosylačních míst, které mohou být modifikovány glykany nebo monosacharidy. Glykany a monosacharidy navázané na receptory regulují klíčové procesy jako je skládání podjednotek, transport na buněčný povrch nebo funkce receptorů. Bylo zjištěno, že abnormální glykosylace ionotropních glutamátových receptorů může mít význam v rozvoji neurologických a psychiatrických poruch jako je například schizofrenie. Tudíž porozumění molekulárním mechanismům, které se podílejí na regulaci glykosylace ionotropních glutamátových receptorů, může mít význam pro vývoj nových způsobů léčby pacientů se změněnou funkcí glutamátergních synapsí v centrální nervové soustavě.
|
|
|
Strukturální podstata mezidruhových rozdílů v aktivaci TRPA1 receptoru
Synytsya, Viktor ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
Ankyrinový receptor TRPA1 je excitační iontový kanál, který zajišťuje převod nocicepčních podnětů na primárních aferentních senzorických neuronech u savců i nižších organismů. Současný výzkum strukturních a funkčních vlastností TRPA1 přináší stále více důležitých poznatků o struktuře a funkci tohoto receptoru, významné mezidruhové rozdíly však často znemožňují jejich přímé porovnání. Naproti tomu, tyto mezidruhové rozdíly mohou být hlavním vodítkem pro identifikaci významných funkčních domén. Cílem práce je zpracovat souhrnný přehled současných poznatků o funkčních a strukturních vlastnostech lidského TRPA1 receptoru a charakterizovat hlavní rozdíly, kterými se liší od jiných orthologů TRPA1 u různých živočišných druhů. Experimentální část se zaměřuje na porovnání aktivačních vlastností lidského TRPA1 receptoru a chiméry, ve které je zaměněna 5. transmembránová doména za homologní oblast TRPA1 receptoru octomilky. Výsledky získané pomocí elektrofyziologické techniky patch-clamp prokazují, že proudové odpovědi aktivované změnami membránového potenciálu jsou významně sníženy u chimérického receptoru, což prokazuje klíčovou úlohu této oblasti pro správnou funkci iontového kanálu. (In Czech) Klíčová slova: ankyrinový receptor, iontový kanál, nocicepce, senzorický neuron, struktura-funkce
|
|
|
Úloha variabilních řetězců na rozhraní podjednotek ve formování ATP-vazebné kapsy a funkci P2X4 receptoru
Tvrdoňová, Vendula ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
5 ABSTRAKT Krystalizace P2X4 receptoru (P2X4R) ze zebřičky ("zebra fish", zfP2X4) v uzavřeném a otevřeném stavu odhalila změny v konformacích ektodomény včetně změn v oblasti styčných ploch mezi levou ("left flipper"; LF) a hřbetní ("dorsal fin"; DF) ploutví. Roli těchto struktur ve formování ATP vazebné kapsy a funkci receptoru jsme zkoumali pomocí alaninové skenovací mutageneze úseků LF (D280-N293) a DF (R203-L214) potkaního P2X4R, a s využitím ATP a analogických agonistů 2-(methylthio)adenosin 5'- trifosfátu, adenosin 5'-(γ-thio)trifosfátu, 2'(3'-O-(4-benzoylbenzoyl)adenosin 5'- trifosfátu a α,β-methylenadenosin 5'-trifosfátu. Sníženou citlivost anebo účinnost ATP mělo 15 z 26 vytvořených mutací. Mutace R203A, N204A a N293A byly v podstatě nefunkční, ale jejich funkci bylo možné obnovit ivermektinem, alosterickým modulátorem P2X4R. Mutace I205A, T210A, L214A, P290A, G291A a Y292A měly změněnou odpověď na ATP a na analogické agonisty. Naproti tomu mutace L206A, N208A, D280A, T281A, R282A a H286A nevykazovaly ve srovnání s divokým typem receptoru žádnou změnu v odpovědích na ortosterické agonisty. Tyto pokusy, společně s homologním modelováním ukázaly, že aminokyseliny z první skupiny nacházející se v horní části obou řetězců LF a DF, se podílejí na přesné organizaci ATP-vazebné kapsy a iniciaci převodu...
|
|
|
Funkční úloha cytoplazmatických konců ankyrinového receptoru TRPA1
Vašková, Jana ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Zemková, Hana (oponent)
Receptor TRPA1 je převážně exprimován na primárních aferentních senzorických neuronech, kde může být aktivován širokým spektrem štiplavých a reaktivních sloučenin, jakými jsou například allyl isothiokyanát nebo cinnamaldehyd. Tyto látky aktivují TRPA1 prostřednictvím kovalentní modifikace cysteinů z cytoplazmatické strany, odkud může být kanál zároveň modulován vnitrobuněčnými vápenatými ionty. Významnou roli v těchto procesech hrají aminové (N-) a karboxylové (C-) konce receptoru. Předkládaná diplomová práce přináší nové poznatky o úloze specifických cytoplazmatických domén v aktivaci TRPA1 receptoru, jež byla studována pomocí elektrofyziologických a molekulárně biologických metod. Měřením membránových proudů TRPA1, vyvolaných chemicky, napětím a vápenatými ionty, byla nalezena vysoce konzervovaná serinová a threoninová rezidua v rámci N-koncové ankyrinové domény, jejichž mutacemi byly silně ovlivněny odpovědi kanálu. Zároveň bylo nově zjištěno, že distální karboxylový konec, o němž bylo již dříve známo, že se podílí na regulaci receptoru vápenatými ionty, přispívá k napěťově závislé aktivaci TRPA1 receptoru.
|
|
|
Molekulární mechanizmy aktivace a modulace TRPV3 receptoru
Chvojka, Štěpán ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent)
TRPV3 receptor je teplotně citlivý iontový kanál patřící do rodiny TRP (transient receptor potential) vaniloidních receptorů. Tento kanál je exprimován v keratinocytech kůže, kde se společně s receptorem pro epidermální růstový faktor (EGFR) podílí na růstu a morfogenezi chlupů, tvorbě kožní bariéry, detekci teplotních změn, vzniku bolesti a pruritu. TRPV3 je aktivován řadou rostlinných produktů, jako je karvakrol z oregána, tymol z tymiánu nebo eugenol z hřebíčku. Jeho unikátní vlastností je senzitizace, postupné zvyšování proudové odpovědi při opakované aplikaci agonisty, molekulární podstata tohoto děje však není dosud objasněna. Jednou ze zvažovaných možností je přímá fosforylace TRPV3 proteinu prostřednictvím signální dráhy zahrnující EGFR a mitogenem aktivovanou protein kinázu MAPK1/MAPK3 (také zvanou ERK2/ERK1). V předložené diplomové práci jsme pomocí elektrofyziologické techniky patch-clamp zjišťovali, zda senzitizace TRPV3 receptoru exprimovaného v buněčné linii lidských imortalizovaných keratinocytů může být ovlivněna mutacemi na predikovaných konsensuálních místech pro fosforylaci MAPK1/MAPK3. Z osmi testovaných mutantů, ve kterých byl zaměněn treonin nebo serin za kyselinu asparagovou mimikující fosforylaci, jsme určili 6 míst, jejichž mutace ovlivnila alespoň jeden z testovaných...
|
|
|
Mechanizmus regulace transportu NMDA receptorů na buněčný povrch
Lichnerová, Katarína ; Horák, Martin (vedoucí práce) ; Bendová, Zdeňka (oponent)
N-methyl-D-aspartátové (NMDA) receptory patří mezi ionotropní glutamátové receptory zapojené v excitačním synaptickém přenosu, synaptické plasticitě a excitotoxicitě. Vytvářejí heterotetramerní komplexy složené z GluN1, GluN2A-D a/nebo GluN3A-B podjednotek, které jsou aktivovány glutamátem a glycinem. Předchozí studie ukázaly, že jednotlivé podjednotky NMDA receptorů, speciálně GluN2 podjednotky, vykazují různé funkční a farmakologické vlastnosti. Cílem mé práce bylo objasnit mechanizmy regulace transportu NMDA receptorů na buněčný povrch. V našich pokusech jsme používali metodu imunocytochemického značení receptorů na heterologních COS-7 buňkách a kulturách granulárních mozečkových neuronů (CGC) exprimujících rekombinantní NMDA receptory. Z výsledků mé práce vyplývá, že transport NMDA receptorů na buněčný povrch je regulován především přítomností GluN2 podjednotek. Naše další výsledky ukázaly, že transport GluN1/GluN2C receptorů je regulovaný třemi specifickými oblastmi GluN2C podjednotky: i.) oblastí A2 segmentu v amino-terminální doméně, ii.) M3 doménou a iii.) proximální částí C-konce obsahující sekvenci pěti aminokyselin, SLPSP. Naše výsledky pomáhají objasnit mechanizmy regulace funkce NMDA receptorů v savčím centrálním nervovém systému a přispívají tak k poznání mechanizmů vzniku různých...
|
|
|
Functional and structural study of thermally activated TRP ion channels: The role evolutionarily conserved motifs in the TRPA1 modulation
Kádková, Anna
Ankyrinový receptor TRPA1 je iontový kanál exprimovaný převážně na primárních aferentních senzorických neuronech, kde působí jako polymodální senzor pro bolestivé a dráždivé podněty. Kromě chemických látek (např. isothiokyanáty, skořicový aldehyd a jeho deriváty, akrolein, menthol) může být aktivován chladem, depolarizací membránového potenciálu nebo vápenatými ionty z intracelulární strany. Iontový kanál TRPA1 je homotetramerem podjednotek, jež jsou topologicky uspořádány do transmembránové oblasti a cytoplazmaticky orientovaných N- a C-konců. Transmembránová oblast je tvořena šesti alfa-helixy propojenými intra- a extracelulárními kličkami. N-konec receptoru se vyznačuje přítomností 16 až 17 ankyrinových repetic (AR), zatímco C-konec je výrazně kratší a má převážně helikální strukturu. Přesná struktura TRPA1 byla částečně rozřešena roku 2015 pomocí kryo-elektronové mikroskopie, avšak funkční úloha jednotlivých oblastí v polymodální aktivaci receptoru není prozatím plně objasněna. Předkládaná disertační práce se zabývá úlohou mezidruhově konzervovaných strukturních a sekvenčních motivů v cytoplazmatických koncích a v S4-S5 oblasti TRPA1 v napěťové a chemické citlivosti receptoru. Pomocí homologního modelování, molekulárně-dynamických simulací, bodové mutageneze a elektrofyziologických technik bylo...
|
host ::
RSS.