|
|
The role of pre-mRNA splicing in human hereditary diseases
Malinová, Anna ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Vanáčová, Štěpánka (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Malá jaderná ribonukleoproteinová částice U5 (U5 snRNP) je jednou z hlavních komponent spliceozomu, komplexu který katalyzuje sestřih pre-mRNA. U5 snRNP je tvořena molekulou RNA a několika proteiny, nicméně o tom jak jsou jednotlivé díly postupně skládány v maturovanou částici, se mnoho neví. Ukázali jsme, že po depleci proteinu PRPF8, jedné z klíčových složek U5 snRNP, se částice správně neskládají a akumulují se v jaderných strukturách zvaných Cajalova tělíska. K objasnění role PRPF8 v biogenezi U5 snRNP jsme se dále rozhodli využít mutace tohoto proteinu, které byly identifikovány u pacientů s degenerativním onemocněním oční sítnice, retinitis pigmentosa (RP). Vytvořili jsme stabilní buněčné linie exprimující mutantní varianty proteinu PRPF8 a ukázali jsme, že RP mutace narušují skládání U5 snRNP, což následně vede ke snížení efektivity sestřihu pre-mRNA v buňkách. Mutantní PRPF8 se spolu s proteinem EFTUD2 hromadí v cytoplazmě a vytvoření tohoto komplexu je zdá se prvním krokem skládání U5 snRNP. Dále jsme s využitím proteomických metod identifikovali řadu nových faktorů včetně komlexu HSP90/R2TP a proteinu ZNHIT2, které se váží na U5 snRNP. Naše výsledky ukazují, že tyto faktory preferenčně interagují...
|
|
|
Formation of splicing machinery in the context of the cell nucleus
Stejskalová, Eva ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Vanáčová, Štěpánka (oponent) ; Malínský, Jan (oponent)
Většina genů kódujících proteiny vyšších eukaryot obsahuje introny, které musí být odstraněny z primárních transkriptů. Vznikající mRNA může být poté použita jako templát pro syntézu proteinů. Sestřih intronů probíhá za pomoci složitého sestřihového komplexu, který se skládá z malých jaderných ribonukleoproteinových částic. Tyto částice vznikají během několika postupných kroků, které se odehrávají jak v jádře, tak v cytoplazmě. Sestřihový komplex se poté postupně skládá na molekule pre- mRNA. Jedná se o velmi dynamický a přesně regulovaný proces, který závisí nejen na sekvenci samotné pre-mRNA, ale záleží i na stavu celého jádra, např. na modifikacích chromatinu. Mezi základní nezodpovězené biologické otázky patří například: Jak buňky řídí, kdy a kde se sestřihový komplex poskládá? Co předurčuje, které introny budou vystřiženy? V této práci zkoumáme sestřihový komplex a jeho skládání v kontextu buněčného jádra z několika různých úhlů pohledu. Za prvé se věnujeme neočekávané souvislosti mezi sestřihovým faktorem U1-70K a komplexem SMN (z angl. survival of motor neurons), který je hlavním účastníkem biosyntetické dráhy malých jaderných ribonukleoproteinových částic. Podařilo se nám odhalit, že protein U1-70K interaguje s komplexem SMN a že tato interakce je klíčová pro stabilitu gems, malých nemembránových...
|
|
|
Mapping of SART3 interactions with spliceosomal snRNPs
Klimešová, Klára ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Hnilicová, Jarmila (oponent)
Sestřih pre-mRNA je katalyzován obrovským a velmi dynamickým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (označovaných jako snRNP) a více než stovky dalších proteinů. Biogeneze sestřihových snRNP částic je komplikovaný proces, jehož závěrečné kroky se odehrávají ve specializovaných jaderných útvarech, Cajalových tělíscích. Molekulární podstata cílení snRNP částic do Cajalových tělísek však zůstává nejasná. Naše předchozí výsledky odhalily, že protein SART3 je důležitý pro akumulaci U4, U5 a U6 snRNP v Cajalových tělíscích, není ale známo, jakým způsobem SART3 tyto sestřihové částice váže. SART3 byl původně identifikován jako interakční partner U6 snRNP a faktor napomáhající složení U4/U6 di-snRNP částice. V této práci nicméně ukazujeme, že SART3 interaguje také s U2 snRNP a že specificky váže nesložené U2 částice. Dále poskytujeme důkazy, že SART3 asociuje s U2 snRNP přes Sm proteiny, které tvoří stabilní jádro čtyř z pěti hlavních snRNP částic (tzn. U1, U2, U4 a U5). Na základě našich výsledků navrhujeme, že interakce mezi SART3 a Sm proteiny představuje obecný mechanismus, jak SART3 rozpoznává nekompletní snRNP částice a kontroluje tak jejich skládání v Cajalových tělíscích.
|
|
|
Recyklace sestřihových komplexů
Klimešová, Klára ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Hálová, Martina (oponent)
Ve většině lidských genů jsou kódující úseky (exony) přerušovány dlouhými nekódujícími sekvencemi (introny). Po přepisu genu do pre-mRNA musí být tyto introny velmi přesně vyštěpeny v procesu zvaném sestřih. Sestřih je zajišťován velmi složitým a dynamickým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (snRNP) a řady sestřihových proteinů. Každá částice obsahuje jednu malou jadernou RNA a několik specifických proteinů a vzniká postupným procesem, který se odehrává v jádře i cytoplazmě. Závěrečné úpravy pak probíhají v jaderných Cajalových tělíscích. Hotové částice nasedají v přesně daném pořadí na pre-mRNA a formují komplex, který katalyzuje dvě transesterifikační reakce potřebné k vystřižení intronu a spojení okolních exonů a následně se opět rozpadá na jednotlivé snRNP. Ribonukleoproteinové částice během sestřihu podstupují nejrůznější změny jak v konformaci, tak v proteinovém složení. Proto musí před každým dalším kolem sestřihu projít recyklačními úpravami a vrátit se do stavu vhodného pro připojení k novému sestřihovému komplexu. Recyklační fázi sestřihového cyklu nicméně zatím obklopuje více otázek než odpovědí. Cílem této práce je pokusit se ve světle nových poznatků alespoň na některé z nich odpovědět.
|
|
|
Mer1 a Nam8 v regulaci sestřihu.
Marková, Michaela ; Abrhámová, Kateřina (vedoucí práce) ; Stejskalová, Eva (oponent)
Proteiny Mer1 a Nam8 vzájemnou kooperací aktivují sestřih čtyř specifických pre-mRNA genů: AMA1, MER2, MER3 a SPO22 potřebných pro meiotickou rekombinaci a jaderné dělení. Exprese těchto genů se v rámci buněčného cyklu nemění, ale k efektivnímu sestřihu jejich pre-mRNA dochází pouze v průběhu meiózy, protože pouze v meiotických buňkách je exprimován protein Mer1, který usnadňuje jejich sestřih. Všechny tyto pre-mRNA obsahují nekonsensuální 5'sestřihové místo (5'splice site, 5'ss), které je ve srovnání s konsensuální sekvencí hůře rozpoznatelné pro podjednotkou spliceosomu U1 snRNP. Na pre-mRNA těchto genů se nachází enhancerová oblast v blízkosti 5'ss, na kterou se váže Mer1p, jenž zefektivňuje vyvazování U1 snRNP. Mer1p spolupracuje prostřednictvím dalších proteinů s Nam8p, který je součástí U1 snRNP. Nam8p se váže na pre-mRNA downstream od 5'ss v blízkosti enhancerové oblasti. Mer1p a Nam8p společně usnadňují sestavování spliceosomu na nekonsensuálním 5'ss a následně sestřih pre-mRNA.
|
|
|
Functional analysis of hPrp8 mutations linked to retinitis pigmentosa.
Matějů, Daniel ; Cvačková, Zuzana (vedoucí práce) ; Král, Vlastimil (oponent)
hPrp8 je esenciální faktor účastnící se sestřihu pre-mRNA. Tento vysoce konzervovaný protein je součástí U5 malé jaderné ribonukleoproteinové částice (U5 snRNP), která představuje jednu ze základních komponent spliceozomu. hPrp8 působí jako klíčový regulátor aktivace spliceozomu a interaguje přímo s U5 snRNA a s oblastmi pre-mRNA, které se účastní transesterifikačních reakcí během sestřihu. Mutace v hPrp8 způsobují autozomálně dominantní formu retinitis pigmentosa (RP), dědičného onemocnění, které vede k postupné degeneraci sítnice. V této práci jsme zkoumali, jak mutace spojené s RP ovlivňují funkci proteinu hPrp8. Použili jsme metodu 'BAC recombineering' k vytvoření mutovaných variant hPrp8-GFP a připravili jsme stabilní buněčné linie exprimující tyto rekombinantní proteiny. Mutované proteiny byly exprimovány a lokalizovány do jádra, avšak jedna z bodových mutací výrazně ovlivnila lokalizaci a stabilitu hPrp8. Další experimenty napověděly, že mutace spojené s RP ovlivňují schopnost hPrp8 interagovat s dalšími komponenty U5 snRNP a s pre-mRNA. Dále jsme studovali biogenezi U5 snRNP komplexů. Pomocí siRNA jsme odstranili hPrp8 a narušili tak formování U5 snRNP komplexu. Zjistili jsme, že nekompletní U5 snRNP komplexy se hromadí v Cajalových tělískách, což značí, že tyto jaderné struktury hrají roli...
|
|
|
Spliceosome assembly
Hausnerová, Viola ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Chalupníková, Kateřina (oponent)
Introny jsou vystřiženy z eukaryotických transkriptů a exony jsou spojeny dohromady během procesu zvaného sestřih pre-mRNA. Sestřih je katalyzován sestřihovým komplexem. Jedná se o velký ribonukleoproteinový komplex složený z pěti malých jaderných RNA a více než stovky proteinů. Tento komplex rozpoznává 5' sestřihové místo, místo větvení a 3' sestřihové místo a následně provádí dvě transesterifikační reakce, jejichž výsledkem je zralá molekula mRNA. V rámci časného sestřihového komplexu je 5' sestřihové místo definováno pomocí U1 snRNP a na rozpoznání místa větvení a 3' sestřihového místa se podílí U2 pomocný faktor (U2 auxiliary factor, U2AF). Spolupráce sestřihových míst byla částečně popsána in vitro, ale situace in vivo není dosud zcela objasněna. V této studii jsme použili fluorescenční rezonanční energetický transfer (Fluorescence resonance energy transfer, FRET) a RNA imunoprecipitaci (RIP) k popsání časných kroků skládání sestřihového komplexu. Abychom detekovali interakce proteinů na RNA molekule přímo v buněčném jádře, uplatnili jsme sestřihové reportéry kódující -globinový gen a vlásenky z fága MS2. Výsledky FRETu ukazují, že intaktní 5' sestřihové místo je vyžadováno pro vazbu U2AF35 na 3' sestřihové místo a že vazba U1C je částečně omezena v přítomnosti mutace 3' sestřihového místa. Dále jsme...
|
|
|
Funkce proteinu Slu7 v sestřihu pre-mRNA Saccharomyces cerevisiae
Ničová, Eva ; Půta, František (vedoucí práce) ; Vašicová, Pavla (oponent)
Alternativní sestřih je jedním z nástrojů regulace genové exprese. Za různých podmínek mohou z jednoho buněčného transkriptu vznikat různé mRNA kódující proteiny s různou funkcí, lokalizací či stabilitou. Lidský protein hSlu7 ovlivňuje alternativní sestřih některých genů prostřednictvím volby alternativních 3'sestřihových míst (3'SS). Ačkoli se původně zdálo, že kvasinky Saccharomyces cerevisiae alternativní sestřih nevyužívají, v poslední době se množí důkazy, že tomu tak není. Rozhodli jsme se proto blíže charakterizovat funkci kvasinkového Slu7, který se účastní druhého kroku sestřihu pre-mRNA a je úzce spjatý s volbou 3'SS. Pozornost jsme zaměřili na vysoce sekvenčně konzervovaný, doposud nepopsaný motiv v esenciální části proteinu, nazvaný motiv RED. Mutace v motivu způsobují defekt druhého kroku sestřihu některých substrátů a ovlivňují poměr využití alternativních 3'SS některých sestřihových konstruktů. Výsledky pokusů ukazují na roli motivu ve výběru především distálních 3'SS. Genetické interakce mutací slu7 s alelami genů PRP45 a PRP22 rozšiřují spletitou interakční síť sestřihových faktorů a naznačují možnou roli Slu7p ve vazbě Prp22p na spliceosom.
|
|
|
Sestřih atypických intronů v S. cerevisiae
Cit, Zdeněk ; Půta, František (vedoucí práce) ; Pichová, Alena (oponent)
Sestřih pre-mRNA je životně důležitý proces významný pro genovou expresi všech eukaryotických organismů. Pro správný průběh tohoto velmi složitého a dynamického děje je zapotřebí několik specializovaných RNA a velké množství proteinů, které zastávají nejrůznější úlohy nejen přímo uvnitř samotného sestřihového komplexu, ale i mimo něj. Jedním z proteinů účastnících se sestřihu pre-mRNA v kvasince Saccharomyces cerevisiae je i Prp45. Jeho lidským homologem je protein SNW1/SKIP, který se mimo sestřihu podílí i na celé řadě dalších funkcí. U proteinu Prp45 byla zatím spolehlivě popsána pouze účast na druhé transesterifikační reakci sestřihu. Objevily se však i informace naznačující jeho možné zapojení do první transesterifikační reakce. Tato práce přináší další poznatky spojující protein Prp45 s prvním sestřihovou reakcí, které byly získány výzkumem buněk nesoucích mutantní alelu prp45(1-169). Buňky nesoucí tuto alelu vykazují mimo zhoršeného sestřihu i akumulaci některých pre-mRNA. Tato práce se proto zabývala i možným vlivem proteinu Prp45 na export RNA z jádra do cytoplasmy. Nebylo však objeveno žádné spojení mezi transportem RNA a tímto proteinem. Klíčová slova sestřih pre-mRNA; Saccharomyces cerevisiae; Prp45; Mer1; Mud2; Prp22; Rrp6; AMA1; SNW1/SKIP
|
|
|
Interakce proteinů Prp22 a Prp45 ve spliceosomu pučící kvasinky
Senohrábková, Lenka ; Půta, František (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Protein Prp22 je DEAH box RNA helikáza, která má dvě funkce v sestřihu pre-mRNA: účastní se druhé transesterifikační reakce (ATP independentní funkce) a uvolňuje maturovanou mRNA ze spliceosomu (ATP dependentní funkce). Prp45p, kvasinkový ortholog lidského transkripčního koregulátoru SNW/SKIP, je esenciální sestřihový faktor, přítomný ve spliceosomu po celou dobu sestřihové reakce. Mutanta prp45(1-169) geneticky interaguje s některými alelami NTC komplexu a sestřihovými faktory druhého kroku, včetně PRP22. Jedním z výsledků této práce je zjištění, že mutanty prp22(-158T) a prp22(-327A), které jsou synteticky letální s mutací prp45(1-169), mají kvůli mutaci v upstream regulační oblasti sníženou hladinu proteinu Prp22. Mutanty prp22(-158T), prp22(300PPI) a prp22(-327A) ovlivňují sestřih pre-mRNA s mutací v 5'ss v závislosti na sekvenci druhého exonu. N-terminální mutanty prp22(∆301) a prp22(∆350) jsou synteticky letální s prp45(1-169). Syntetická letalita je možná způsobena snížením efektivity vazby Prp22p do spliceosomů na úroveň, která není pro buňky již viabilní.
|
host ::
RSS.