|
|
Expression of ubiquitin ligases in gastrointestinal tract
Pícková, Markéta ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
Ubiquitin (Ub) ligázy jsou důležité regulační a signální enzymy, které se účastní většiny přirozených dějů v buňce, jako je diferenciace, oprava poškozené DNA, regulace energetického metabolismu či imunitní reakce. E3 Ubiquitin ligázy jsou také zodpovědné za patofyziologické změny v organismu a jejich činnost je spojována s řadou významných lidských chorob, včetně nádorových onemocnění. To z nich činí nadějný diagnostický a farmaceutický cíl. Dle dřívějších výsledků vykazují tyto enzymy značně specifickou expresi na úrovni buněčných typů nebo tkání. Zmapování této specifické exprese je důležité pro určení jejich biologické úlohy. V této diplomové práci bylo systematicky zmapováno 370 genů E3-Ub ligáz v gastrointestinálním traktu za normálních podmínek a během akutního zánětu tlustého střeva. Získaná data nám umožnila vyselektovat geny, které mohou hrát důležitou roli, jak v udržování homeostázi, tak v patofyziologických procesech a regeneraci gastrointestinálního traktu. Práce se opírá o expresní profilování jednotlivých tkání trávicí soustavy pomocí qPCR, které je doplněno in situ hybridizací, pro přesnější určení lokalizace exprese daného genu ve tkáni. Analýzou qPCR výsledků bylo predikováno sto třicet sedm kandidátů, které regulují fyziologickou funkci trávicí soustavy a třicet čtyři genů...
|
|
|
Hledání fysiologického partnera proteinu Ddi2 (DNA damage-inducible protein homolog 2)
Kurfürst, Jaroslav ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Jedním z nejdůležitějších buněčných procesů, a to nejen pro degradaci proteinů, je takzvaný ubikvitin-proteasomový systém. V něm hraje klíčovou úlohu ubikvitin, malý protein s jedinečnou schopností řetězit se. Buněčné proteiny, označené daným ubikvitinovým řetězcem a tím předurčené k degradaci, se dále dostávají do proteasomu dvojím způsobem. Buď přímou interakcí polyubikvitinového řetězce značícího daný protein s jedním z receptorů proteasomu, nebo pomocí tzv. adaptorových proteinů. Tyto proteiny jsou charakteristické doménou, která je ubikvitinu podobná a doménou, která jej váže. Zejména pomocí těchto domén zprostředkovávají adaptorové proteiny doručování určitých substrátů do proteasomu. Adaptorový protein Ddi2 z této proteinové skupiny vyčnívá přítomností další domény, jež je strukturně podobná například protease viru HIV a jejíž proteolytická aktivita byla teprve nedávno objevena. Doménové uspořádání a zejména přítomnost proteolytické domény proteinu Ddi2 dává vzniknout hypotéze, že by Ddi2 mohl být deubikvitinačním enzymem. Tato hypotéza byla v předkládané práci ověřována sledováním možného štěpení diubikvitinových řetězců rekombinantně připraveným Ddi2 proteinem. Bylo zjištěno, že Ddi2 v daném uspořádání nemá deubikvitinační aktivitu.
|
|
|
Ddi1-like proteins: a novel family of retroviral-like aspartyl proteases
Šmilauerová, Kristýna ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Šmahel, Michal (oponent)
Ubikvitin-proteasomový systém je jedním z klíčových procesů podílejících se na udržení homeostáze buňky. Jeho hlavním úkolem je degradovat poškozené, špatně sbalené či nepotřebné proteiny. Podílí se ale také na celé řadě dalších procesů jako jsou například opravy DNA, regulace buněčného cyklu či signalizace. Celý systém se skládá z mnoha komponent, které jsou vzájemně úzce regulovány. Jednou ze skupin účastnících se ubikvitin- proteasomového systému jsou tzv. proteasomové adaptorové proteiny. Ty rozpoznávají substráty určené k degradaci a transportují je k proteasomu - místu degradace. Mezi tyto proteiny se řadí i rodina Ddi1 podobných proteinů (z angl. DNA damage-inducible protein 1), která se vyznačuje doménou podobnou retrovirovým aspartátovým proteasam. Biologické funkce této proteinové rodiny jsou objasněny jen částečně, a to zejména u Ddi1 pocházející z kvasinky Sacharomyces cerevisiae, a jsou proto předmětem aktivního výzkumu. Tato práce shrnuje dosavadní poznatky a publikované informace o této proteinové rodině, popisuje její obecné charakteristiky, známé funkce, zasazuje je do kontextu buněčných procesů a tím poukazuje na další možné směry výzkumu.
|
|
|
Studies towards biological function of ubiquitin E3 ligase Rnf121 in vivo and in vitro
Škarabellová, Kateřina ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
Přestože je RING finger protein 121 (RNF121) vysoce konzervovaná E3 ubiquitin ligáza, a to od Caenorhabditis elegans k člověku, její funkce není moc známá a u vyšších eukaryot byla zatím studována jen na úrovni in vitro. Pro RNF121 byly popsány různé funkce: i) RNF121 funguje jako široký regulátor NF-κB aktivace, ii) ukázalo se, že kontroluje transport membránových proteinů uvnitř buňky, a iii) jeho downregulace vede k apoptóze. Kromě toho může mít RNF121 roli také při rakovině a to na základě nasledovních dat: 16.4-krát vyšší exprese byla zjištěna u pacientů trpících Barrettovým jícnem (prekancerózním stádiem adenokarcinomu jícnu) a tato exprese byla ještě vyšší u adenokarcinomu v porovnání se zdravou populací. Navíc je RNF121 gen lokalizován v kandidátní oblasti DNA obsahující geny, které se mohou účastnit vzniku rakoviny prsu. Za účelem studia fyziologické funkce RNF121, byl v Českém centru pro fenogenomiku připraven myší Rnf121 knockout, který byl dále studovaný v naší laboratoři. Křížení Rnf121+ /- myší poukázalo na prenatální letální fenotyp Rnf121-/- embryí, která odumírala před embryonálním dnem (E) 11.5. Předběžné experimenty provedené v naší laboratoři prokázaly četné vaskulární defekty v homozygotně mutantním embryu, ve žloutkovém vaku a v placentě. Tato diplomová práce byla zaměřena na...
|
|
|
Vliv povrchové ubiquitinace spermií na časný embryonální vývoj u prasat
Kroumanová, Kristýna ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Nevoral, Jan (oponent)
Ubiquitin-proteazomální systém, jehož hlavní funkcí je degradace proteinů v buňce, se účastní také selekce spermií v epididymis. Defektní spermie jsou zde extracelulárně ubiquitinovány a následně degradovány, přičemž míra povrchové ubiquitinace spermií negativně koreluje s jejich kvalitou. Vzhledem k tomu, že v ejakulátu savců jsou přítomné povrchově ubiquitinované spermie, které nejspíš unikly selekci, nabízí se hypotéza, zda oocyt nerozpoznává takto označené spermie po oplození (pravděpodobně přes 26S proteazomální komplex) a nezpůsobuje jejich poškození či degradaci, což by ve svém důsledku mělo vést k omezení, či úplnému zastavení vývoje potencionálně defektního embrya. Tato práce řeší vliv povrchové ubiquitinace spermií na časný embryonální vývoj u prasete domácího (Sus scrofa f. domestica) s využitím metody intracytoplazmatické injekce spermie (ICSI). Úspěšnost embryonálního vývoje do stádia blastocysty po ICSI byla srovnatelná s jinými laboratořemi. V rámci této práce nebyl zaznamenán signifikantní rozdíl v tvorbě prvojader mezi oocyty oplozenými spermiemi s nízkou nebo vysokou mírou povrchové ubiquitinace. Naopak signifikantně lepší vývoj embryí do stádia blastocysty byl prokázán u oocytů oplozených spermiemi s nízkou mírou povrchové ubiquitinace (17 %) oproti oocytům oplozených vysoce povrchově...
|
|
|
Vliv ubiquitin-proteazomálního systému na spermiogenezi u savců
Kroumanová, Kristýna ; Petelák, Aleš (vedoucí práce) ; Krejčová, Tereza (oponent)
Spermiogeneze je komplikovaný proces, při kterém se haploidní spermatidy diferencují na morfologicky zralé spermie. Morfologické změny zahrnují děje jako kondenzace chromatinu a nahrazení histonů protaminy, splývání cisteren Golgiho aparátu za tvorby akrozomálního váčku, tvorba bičíku, redukce cytoplasmy a přeskupování organel. Při těchto událostech hraje důležitou roli ubiquitin-proteazomální systém. Ubiquitinace je posttranslační modifikace, která vede především ke značení intracelulárních proteinů určených k degradaci ve 26S proteazomu. Důležitost ubiquitinace při tvorbě spermií dokazuje fakt, že deficience ubiquitin-proteazomálního komplexu při spermiogenezi může vést k neplodnosti různého stupně. Během následné maturace spermií v epididymis dochází k extracelulárnímu značení abnormálních spermií ubiquitinem a kontrole kvality spermií. Ubiquitin-proteazomální systém hraje významnou roli i při oplození, kdy je 26S proteazom obsažený ve spermii spoluzodpovědný za penetraci zony pellucidy. Cílem této práce je popsat vliv ubiquitin-proteazomálního systému během různých fází spermiogeneze u savců.
|
|
|
DNA viry a proteazomální systém buňky
Vinšová, Barbora ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Motlová, Lucia (oponent)
Rozvoj virové infekce závisí na interakcích viru s hostitelskou buňkou. Po miliony let trvající koevoluce virů s jejich hostiteli vedla ke vzniku mnoha antivirových obranných mechanismů i virových únikových taktik. Viry se naučily zasahovat do různých buněčných dějů, pozměňovat je a využívat jednotlivé buněčné komponenty ve svůj prospěch. Jednou takovou hojně využívanou komponentou je i ubikvitinačně-proteazomální systém. Proteazomy jsou vícepodjednotkové proteinové struktury, které za normálních okolností umožňují degradaci poškozených, špatně sbalených či přebytečných buněčných proteinů. Svou funkcí se podílejí na regulaci různých buněčných procesů a na udržování proteinové rovnováhy. Viry tyto struktury využívají k degradaci proteinů za účelem úniku imunitnímu systému a deregulace buněčného cyklu, k rozbalování a vstupu virionů do buněk či ke zvýhodnění vlastní replikace. Tato práce je koncipována jako stručný přehled interakcí buněčného ubikvitinačně-proteazomálního systému s DNA viry.
|
|
|
Vliv ubiquitinace spermií v rámci časného embryonálního vývoje u prasete
Petelák, Aleš ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Metoda intracelulární injekce spermie je velmi efektivním nástrojem pro výzkum oplození. Po vytvoření nové laboratoře na půdě PřF UK bylo nutné nejdříve tuto metodu zavést a charakterizovat časný embryonální vývoj oplozených oocytů. Oocyty byly po oplození kultivovány do stadia blastocysty s úspěšností srovnatelnou s jinými laboratořemi (17%). Ubiquitin-proteazomální systém, který v buňce zajišťuje degradaci proteinů, se účastní regulace maturace a selekce spermií a je nezbytný pro penetraci vitelinní membrány. V těchto dějích je jeho funkce lokalizována extracelulárně. U spermií míra ubiquitinace koreluje s jejich kvalitou. Hypoteticky lze tedy předpokládat, že ubiquitinace nekvalitních spermií slouží jako negativní marker pro jejich rozpoznání a degradaci oocytárním 26S proteazomálním komplexem. Experimenty byly plánovány na základě předpokladu, že výkonnou částí selekčního mechanismu je 26S proteazom a z tohoto důvodu byl sledován vliv inhibice 20S proteazomu, pomocí peptidu MG132, na formování prvojader a následný časný embryonální vývoj po ICSI. Z pohledu zahájení dekondenzace spermie se neprojevil žádný účinek inhibice. Signifikantní rozdíl byl pozorován ve formování prvojader. U skupiny s MG132 docházelo k tvorbě prvojader jen v malém počtu případů (17%, 9%), oproti skupině bez inhibitoru...
|
host ::
RSS.