|
|
Imunohistochemické a molekulárně-genetické markery v predikci progrese neoplázií jícnu v korelaci s patofyziologií
Kollár, Marek ; Martínek, Jan (vedoucí práce) ; Suchánek, Štěpán (oponent) ; Mandys, Václav (oponent)
Úvod: Karcinom jícnu představuje celosvětově osmou nejčastější malignitu. Dva nejčastější typy jsou adenokarcinom a spinocelulární karcinom. Správná histopatologická diagnóza, staging a určení prediktivních rizikových markerů v progresi jsou klíčové pro vývoj nemoci, osud a management pacienta. Endoskopickou resekci lze považovat za kurativní léčbu v případech R0 resekce karcinomu se slizniční invazí nebo s invazí do horní třetiny submukózy. Pacienti s pokročilejšími karcinomy jsou referováni k chirurgické, případně onkologické terapii. Zlatým standardem v diagnostice je histopatologie, častokrát s využitím imunohistochemie, například s průkazem mutace genu TP53, který hraje důležitou roli v patogenezi progrese lézí jícnu. Velký význam mají také nové diagnostické metody, mezi které například patří konfokální laserová endomikroskopie (CLE). Neméně důležité je sledování pacientů i po endoskopické léčbě s cílem včasného a spolehlivého odhalení perzistentní či rekurentní léze. Cíle, metody a pacienti: V práci jsou celkově zpracovány čtyři samostatné, na sebe částečně navazující projekty, s parciálním překryvem pacientů. Cíle jednotlivých projektů byly: 1) Stanovit prediktivní markery progrese karcinomu jícnu, riziko metastázování a generalizace a porovnat efektivitu endoskopické a chirurgické terapie u...
|
|
|
Charakterizace vazebného rozhraní komplexu transkripčních faktorů FOXO4 a p53
Brzezina, Adam ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Tato práce se zabývá studiem lidských transkripčních faktorů FOXO4 a p53. FOXO4 je členem podrodiny "O" FOX transkripčních faktorů. Geny kódující FOXO proteiny jsou evolučně konzervované mezi druhy. FOXO transkripční faktory regulují expresi genů, které se podílí na řízení metabolismu, buněčného cyklu a buněčné proliferace, přežití buněk a odolnosti vůči stresu. Pro svou schopnost zastavit buněčný cyklus a vyvolat apoptózu jsou považovány za tumorové supresory. Jejich funkce v rámci tumorigeneze se však ukazuje být složitější, protože nedávné studie poukazují na horší prognózu vývoje nádorů, u kterých je vyšší hladina exprese FOXO4. Protein p53 je důkladně studovaným přirozeně se vyskytujícím tumorovým supresorem. Buněčná odpověď po jeho aktivaci je do jisté míry podobná jako v případě FOXO4, rovněž umí blokovat progresi buněčného cyklu nebo vyvolat apoptózu v závislosti na buněčném typu a závažnosti/typu buněčného stresu. FOXO4 i p53 se ukazují být klíčové molekuly ovlivňující stárnutí. Za stresových podmínek spolu p53 a FOXO4 interagují, a společně tak zvyšují expresi proteinu p21, čímž indukují přechod buněk do senescentního stavu. Akumulace senescentních buněk je považována za jednu z hlavních příčin stárnutí a rozvoje s věkem spojených patologií. Tato bakalářská práce vznikla jako součást...
|
|
|
Modulace DNA vazebné afinity transkripčních faktorů FOXO a p53 prostřednictvím protein-proteinových interakcí
Hofmanová, Adéla ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
4 Abstrakt Podtřída "O" transkripčních faktorů forkhead box (FOXO) představuje skupinu proteinů, které hrají zásadní roli v celé řadě buněčných procesů souvisejících se stresem, glukoneogenezí, kontrolou buněčného cyklu, apoptózou, senescencí a opravami poškozené DNA. Obecně jsou považovány za supresory nádorů. Ukázalo se však, že mohou naopak podporovat tumorigenezi a vyvolávat rezistenci na použitá chemoterapeutika. Navzdory mnoholetému výzkumu biologické role FOXO proteinů zůstává stále celá řada otázek, které je třeba zodpovědět. Je například otázkou, zda se nepatrné strukturní rozdíly pozorované v jinak vysoce homologních DNA-vazebných doménách jednotlivých zástupců FOXO promítají do jejich schopnosti vázat DNA. Není zcela jasné ani to, jak vazbu na DNA ovlivňují protein-proteinové interakce s vazebnými partnery. Nedávno byla popsána interakce FOXO transkripčních faktorů s proteinem p53, který bývá nazýván strážcem genomu kvůli zprostředkovávání reakce na akutní poškození DNA. Zdá se, že by vzájemná interakce proteinů FOXO a p53 mohla mít zásadní vliv na DNA vazebnou afinitu obou těchto proteinů. Na základě toho byly v rámci této práce exprimovány a purifikovány DNA-vazebné domény lidských transkripčních faktorů FOXO1, FOXO3 a FOXO4 (FOXO1(144-270), FOXO3(142-267) a FOXO4(86-211)) a transaktivační...
|
|
|
Mutant p53 protein and its binding and transactivation properties
Vojsovič, Matúš ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The "genome guardian" protein p53 plays an important role in cancer growth. P53 mutations occur in more than 50 % of human cancers. Mutated proteins significantly affect the proper functioning of cells. Due to the mutation, proteins can gain, but also lose, some of their functions, which also help them in modulating cell metabolism. Mutant forms of p53 may be involved in indirect binding or direct binding to DNA. They appeared to have a lower binding activity to the DNA than non-mutated p53. The experimental part of the thesis focuses on measuring the binding properties of selected p53 mutants using gel retardation analysis and using an atomic force microscope and monitoring the transactivation potential. The results were compared with the wild-type form of p53. It has been found that binding to the most common types of local DNA structures reduces the binding activity of p53 mutants over the wild-type. P53 mutants has been shown to have a lower intensity of transactivation than the wild-type p53 by studying their transactivation abilities and also they are able to reduce the intensity of transactivation when co-expressed with p53.
|
|
|
Cílové geny a regulace hypoxií indukovaných faktorů HIF1a a HIF2a
Blahová, Tereza ; Žurmanová, Jitka (vedoucí práce) ; Alánová, Petra (oponent)
Pro dnešní podobu života na zemi je kyslík nezbytný, je konečným akceptorem elektronů v dýchacím řetězci a umožňuje efektivní tvorbu ATP oxidativní fosforylací. Nedostatečná dostupnost kyslíku snižuje produkci energie a může ohrozit procesy udržující stálé vnitřní prostředí organismu. Proto jsou vyvinuty kompenzační mechanismy, jimiž buňka reaguje na hypoxii. Hlavním regulátorem buněčné odpovědi je hypoxií indukovaný transkripční faktor HIF. Obecně HIF-1 izoforma podporuje glykolýzu a dostupnost glukózy, blokuje energeticky náročné děje v buňce a zmírňuje tak ztráty energie. HIF-2 izoforma stimuluje antioxidační mechanismy snižující množství reaktivních forem kyslíku, které by mohly poškodit buňku. Současně se obě izoformy podílejí na zvýšení přísunu kyslíku aktivací erytropoézy a angiogeneze v postižené oblasti. Tyto změny zajišťují buď přímo, pomocí svých cílových genů, nebo interakcí s jinými transkripčními faktory a ovlivněním buněčných signálních drah.
|
|
|
Posttranslační modifikace adaptorového proteinu DAXX v buněčné odpovědi na genotoxický stres
Bražina, Jan ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Vodička, Pavel (oponent)
Zachování kontinuity chromozomů a úplné genetické informace v lidských buňkách je rozhodující pro přežití buňky resp. celého organismu a zabraňuje konverzi normálních diploidních buněk v buňky s nestabilním genomem. Buněčná DNA je však vystavována endogennímu i exogennímu stresu, který může vést k poškození její struktury. Během evoluce se ve vyšších eukaryotech vyvinulo několik molekulárních mechanismů, které tato poškození detekují a opravují, a zajišťují tak v buňkách chromosomovou stabilitu. Tato odpověď se nazývá buněčná odpověď na poškození DNA (DDR). Jedním z nejzávažnějších druhů poškození DNA jsou tzv. dvojřetězcové zlomy (DSB), kdy dojde v těsné blízkosti k přerušení kovalentní vazby mezi cukrem a fosfátem. DSB spouští vlnu posttranslačních modifikací, které regulují proteinové interakce, jadernou lokalizaci a katalytickou aktivitu desítek až stovek proteinů. Tyto modifikace zahrnují acetylace, metylace, SUMOylace, ubikvitinylace a zejména pak fosforylace. Mezi nejvýznamnější kinázy účastnící se DDR jsou kinázy ATM, ATR a DNA-PK, jež jsou aktivovány bezprostředně po detekci poškozeného místa. DAXX (death-associated protein 6) je adaptorový, převážně jaderný protein, který se se v buňkách účastní sbalování histonové varianty H3.3, remodelace chromatinu, modulace genové exprese či...
|
|
|
Srovnání vlastností buněčných linií rezistentních k ellipticinu, doxorubicinu a cisplatině
Černá, Tereza ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Eckschlager, Tomáš (oponent)
6 Abstrakt Neuroblastom je nejčastější solidní extrakraniální nádor dětského věku. I přes veškeré pokroky v onkologické diagnostice a terapii je léčba některých forem neuroblastomu stále obtížná. Jednou z největších komplikací chemoterapie je vznik lékové rezistence. Tato práce se zabývá vlivem cytostatik na expresi vybraných proteinů, které se mohou podílet na chemorezistenci lidské neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-4 na proteinové úrovni i na úrovni genové exprese. Senzitivní linie UKF-NB-4 a od ní odvozené rezistentní linie UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO a UKF-NB-4ELLI byly vystaveny působení cisplatiny, doxorubicinu nebo ellipticinu po dobu 24, 48 a 72 hodin. Metodou Western blot bylo prokázáno, že cytostatika cisplatina, doxorubicin nebo ellipticin podaná senzitivní neuroblastomové buněčné linii UKF-NB-4 v množstvích, která jsou přidávána do kultivačního média rezistentních neuroblastomových linií pro udržování rezistence, indukují po 72 hodinové kultivaci v této buněčné linii expresi proteinu p53 a zároveň snižují množství retinoblastomového proteinu pRb. Rozdíly v expresi proteinu RAS, cytochromů P450 1A1, 3A4 a cytochromu b5 nebyly prokázány. Změny v expresi studovaných proteinů u rezistentních linií UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO a UKF-NB-4ELLI kultivovaných s a bez přídavku daného cytostatika nejsou...
|
|
|
Role of Smarca5 (Snf2h) chromation remodeling ATPase in hematopoitic development and erythropoiesis
Kokavec, Juraj ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Divoký, Vladimír (oponent) ; Kořínek, Vladimír (oponent)
Jaderný protein Smarca5 (Snf2h) je jeden z nejvíce konzervovaných chromatin remodelačních faktorů a molekulárních motorů u savců. ATPáza Smarca5 (a ostatní příbuzní zástupci proteinové nadrodiny SWI/SNF2) společně se svými vazebnými partnery vytváří několika podjednotkové remodelační komplexy, jež posouvají, odstraňují nebo přináší histonové oktamery na DNA za účelem regulace trankripce, replikace, oprav poškození DNA a jiných nepostradatelných buněčných funkcí. Ve své disertační práci se zabývám studiem myšího modelu delece genu Smarca5 na počátku definitivní krvetvorby. Jedinci s delecí genu Smarca5 v hematopoetické kmenové buňce (aktivní promotor Vav1) umírají během pozdního vývoje in utero v důsledku závažné anémie. Ve fetálních játrech těchto experimentálních zvířat jsme pozorovali akumulaci krvetvorných kmenových a progenitorových buněk (HSPCs) a inhibici jejich dozrávání do erythroidní a myeloidní buněčné řady. Popsané poruchy vývoje byly doprovázeny dysplastickými změnami na úrovni proerytroblastů a poruchami buněčného cyklu na přechodu z G2 do M fáze u bazofilních erytroblastů. Dále jsme pozorovali, že nedostatečná funkce Smarca5 zvyšuje hladinu tumor supresorového proteinu p53 v erythroidních progenitorech, aktivaci jeho transkripčních cílů a k postranslačním modifikacím, jež jsou...
|
|
|
Využití kvasinkového isogenního systému pro studium interakcí proteinu IFI16 s DNA
Kratochvilová, Libuše ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovaného proteinu 16 (IFI16) k sekundárním lokálním strukturám G-kvadruplexu (G4) a jeho mutacím v jednohybridním kvasinkovém systému (Y1H). Protein IFI16 v buňce rozpoznává vlastní a cizorodou nebo poškozenou DNA, podílí se na tvorbě inflamazomu a indukuje expresi interferonu typu I (IFN-I). Rovněž má podíl na regulaci transkripce a restrikci virové infekce. Bylo prokázáno, že protein IFI16 se preferenčně váže ke strukturám G-kvadruplexů a je schopen je touto vazbou stabilizovat. G-kvadruplexy jsou řazeny mezi nekanonické struktury DNA a RNA tvořené sekvencemi bohaté na G. Snadno jsou tvořeny za fyziologických podmínek a nachází se v řadě významných regulačních strukturách genomu jako jsou telomery nebo promotory onkogenů. Jsou také součástí řady virových genomů. To z nich dělá vynikající potenciální cíle při léčbě nádorových a virových onemocnění. V první experimentální části práce byly připraveny nové reportérové kmeny kvasinek S. cerevisiae metodou Delitto Perfetto, které se lišily pouze v sekvenci s potenciálem tvorby G-kvadruplexu, které byly navrženy a analyzovány programem DNA Analyser. Správnost vkládaných sekvencí byla ověřena PCR a Sangerovým sekvenováním a srovnáním s dodanými sekvencemi oligonukleotidů programem Blast. V druhé části práce byly nově připravené kmeny transformovány vektory pro expresi proteinů p53, IFI16 a posuzován vliv vazby IFI16-G4 na expresi reportérového genu ve spojitosti s nádorovým supresorem p53 s využitím luciferázových reportérových testů. Vyhodnocení proběhlo na základě statistické analýzy velikostí účinků získaných po normalizování signálu luminescence na optickou hustotu kultury při vlnové délce 600 nm. Ze získaných výsledků vyplývá, že protein IFI16 má různý vliv na trans-aktivační potenciál nádorového supresoru p53 v závislosti na vazbě k vznikajícím strukturám v blízkosti promotoru genu, a že k úspěšnému vytvoření G-kvadruplexu bylo třeba dosáhnout prahové hodnoty G4Hunteru skóre alespoň 1,591 a zohlednit potenciál dané sekvence formovat úspěšně alespoň 2 G-tetrády.
|
|
|
Influence of cultivation conditions on the production of recombinant proteins
Gardošová, Zuzana ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Recombinant proteins are produced by using genetic modifications. In this process is insert contained gene encoding a certain protein in a cloning vector cloned into the host organism. Recombinant proteins are expressed after the transformation of the cloning vector into a host, the host organism. The expression of recombinant proteins in bacterial cells is one of the most efficient ways to manufacture these proteins. The p53 protein is a tumor suppressor protein, the main role in cells is to react on DNA damage. Due to the reaction to various intracellular and extracellular stimuli, including DNA damage, the p53 protein shows different biological functions, including regulation of senescence, cell cycle, or apoptosis. The theoretical part of the thesis part presents the basic properties of proteins, methods of recombinant protein expression, methods of protein isolation, and characterization of p53 protein. The aim of the experimental part was to determine the effect of incubation temperature on recombinant p53 protein production. The work involves the isolation of plasmid DNA and its transformation into E. coli production cells. The produced proteins were successfully isolated and subsequently characterized by SDS-PAGE and Western Blotting.
|
host ::
RSS.