|
|
The role of DNA repair pathways in ovarian cancer therapy response
Vallušová, Dominika ; Opattová, Alena (vedoucí práce) ; Rössner, Pavel (oponent)
Karcinom vaječníků je závažné a velmi rozšířené gynekologické nádorové onemocnění. V jeho léčbě se jako léčivo první volby používá karboplatina. Avšak, po počáteční terapeutické odpovědi může docházet k relapsu onemocnění s vyvinutou rezistencí vůči karboplatine. Právě nedostatečná odpověď na léčbu a chemorezistence bývá častým důvodem vysoké mortality v rámci tohoto onemocnění. Dráhy odpovědné za opravu poškozené DNA mají význam v terapeutické odpovědi na karboplatinu a taktéž ve vzniku rezistence. Obnova funkce dráhy homologní rekombinace v nádorech je klíčovým mechanismem získané rezistence vůči platinovým derivátům. Na základě těchto poznatků jsme vypracovali hypotézu, že inhibicí homologní rekombinace by bylo možné zvýšit citlivost na karboplatinu. Z tohoto důvodu je hlavním cílem naší práce definovat roli oprav dvouřetezcových zlomů v odpovědi na chemoterapii u karcinomu vaječníků. Protein MRE11 je součástí komplexu MRN, který se účastní opravy dvouřetezcových zlomů. Pomocí mirinu, farmaceutického inhibitoru MRE11, jsme se snažili zjistit vliv homologní rekombinace na účinek karboplatiny a také její roli v získané resistenci. V praktické části práce jsme pomocí biostatistické analýzy ozřejmili asociaci mezi zvýšenou expresí MRE11 a horším přežíváním pacientů s diagnostikovaným karcinomem...
|
|
|
The functional in vitro analysis of the BRCA1alternative splicing variants
Ševčík, Jan ; Kleibl, Zdeněk (vedoucí práce) ; Stopka, Tomáš (oponent) ; Macůrek, Libor (oponent)
Úvod: Inaktivace tumor supresorového genu BRCA1 je predispozičním faktorem vzniku karcinomu prsu a ovaria. Vznik funkčně odlišných nádorově specifických alternativních sestřihových variant může být možným mechanismem snižujícím aktivitu BRCA1 v procesu reparace dvouřetězcových zlomů DNA (DDSB). V této práci jsme funkčně charakterizovali dvě alternativní sestřihové varianty BRCA114-15 a BRCA117-19, nalezené v průběhu genetického screeningu jedinců s vysokým rizikem vzniku karcinomu prsu.Metody: Pro funkční in vitro analýzu jsme vytvořili modelový systém klonů buněčné linie MCF-7 stabilně exprimujících zkoumané varianty. Pomocí comet assay a konfokální imunomikroskopie jsme v tomto systému sledovali vliv BRCA114-15 a 17-19 variant na kinetiku reparace DDSB a proliferaci. Aktivita DNA reparačních procesů byla stanovena přímo pomocí in vitro NHEJ assay a nepřímo testem senzitivity na mitomycin C. Proliferační aktivita byla stanovena klonogenním testem a růstovými křivkami. Výsledky: Exprese BRCA114-15 a 17-19 zvyšuje v MCF-7 buňkách úroveň endogenního poškození DNA, zpomaluje reparaci DDSB, negativně ovlivňuje tvorbu reparačních komplexů v počáteční fázi reparace a prodlužuje jejich trvání. Varianty BRCA114-15 a 17-19 rozdílně ovlivňují aktivitu HR, NHEJ a radiosensitivitu MCF-7 buněk. Závěr: Zvýšení exprese...
|
|
|
Role DNA reparačních mechanismů v patogenezi myelodysplastického syndromu.
Válka, Jan ; Čermák, Jaroslav (vedoucí práce) ; Pospíšilová, Dagmar (oponent) ; Penka, Miroslav (oponent)
Souhrn Předpoklady a cíle: Vysoký výskyt mutací a cytogenetických abnormalit u pacientů s myelodysplastickým syndromem (MDS) naznačuje přítomnost defektů v mechanismech DNA reparace. První část práce se zaměřuje na monitoraci genové exprese DNA reparačních genů a její změny v průběhu progrese onemocnění. Ve druhé části studie bylo použito sekvenování nové generace k detekci jednonukleotidových polymorfismů (SNP) a mutací v DNA reparačních genech a byla hodnocena možná asociace těchto genetických abnormalit s rizikem rozvoje MDS. Metody: Expresní profilování 84 DNA reparačních genů bylo provedeno na CD34 pozitivních buňkách kostní dřeně pacientů s MDS. Skríningová kohorta sestávala z 28 pacientů a exprese vybraných genů byla dále hodnocena v rozšířené kohortě 122 pacientů se všemi podtypy MDS. Sériové vzorky byly použity k monitoraci exprese genů RAD51 a XRCC2 v průběhu progrese onemocnění. Imunohistochemický průkaz RAD51 rekombinázy byl proveden u trepanobioptických vzorků. Cílené sekvenování exonových oblastí 84 DNA reparačních genů bylo provedeno ve skríningové kohortě MDS pacientů. Real-Time PCR byla použita ke zhodnocení genotypu vybraných SNP v populační studii. Výsledky: Geny RAD51 a XRCC2 vykazovaly odlišnou expresi mezi MDS nízkého a vysokého rizika (p < 0,0001), zatímco exprese genu RPA3 byla...
|
|
|
Role proteinu BopN v sekrečním aparátu typu III u bakterií rodu Bordetellae
Kincová, Veronika ; Kamanová, Jana (vedoucí práce) ; Večerek, Branislav (oponent)
Bakterie rodu Bordetella jsou původci vysoce nakažlivého černého kašle u lidí (B. pertussis, B. parapertussis) nebo respiračních onemocnění u ostatních savců (B. bronchiseptica, B. parapertussis). Jedním z faktorů virulence rodu Bordetella je i sekreční systém typu 3 (T3SS), který slouží k dopravě efektorových proteinů přímo z cytozolu bakterie do cytozolu eukaryotické buňky. Protein BopN je substrátovým proteinem T3SS, jemuž je přisuzována efektorová funkce. Nicméně proteiny homologní proteinu BopN u jiných bakterií zprostředkovávají regulaci hierarchické sekrece skrze T3SS a některé z nich jsou zodpovědné i za inhibici sekrece skrze T3SS v prostředí s 2 mM Ca2+, např. v tělních tekutinách hostitele, pokud ještě nedošlo ke kontaktu bakterie s cílovou buňkou. Tato práce se zabývá funkcí proteinu BopN a rovněž rolí vápenatých iontů v aktivitě T3SS u B. bronchiseptica. Aktivita T3SS v médiu bez vápníku a po přídavku 2 mM vápníku byla stanovena 2 nezávislými metodami. Bylo zjištěno, že 2 mM přídavek vápníku vede ke snížení sekrece T3SS reportéru do média a tato regulace je závislá na přítomnosti proteinu BopN. Podobný vliv vápenatých iontů na sekreci skrze T3SS byl pozorován i pomocí hmotnostní spektrometrie. BopN protein reguloval mobilizaci a sekreci translokátorového proteinu T3SS, BopD. Role...
|
|
|
Odpověď na poškození DNA během vývoje savčích oocytů
Vachová, Veronika ; Šolc, Petr (vedoucí práce) ; Nevoral, Jan (oponent)
Oocyt je během raného embryonálního vývoje zastaven v profázi I. meiotického dělení, kde setrvává po dobu několika let. Teprve po dosažení pohlavní dospělosti a vlně luteinizačního hormonu dochází u jednotlivých oocytů ke znovuzahájení meiózy a meiotickému zrání. Oocyt je následně opět zastaven v metafázi II. meiotického dělení, kdy je ovulován a čeká na oplození. Během svého vývoje je vystaven působení faktorů způsobujících DNA poškození, z nichž mezi nejzávažnější patří dvouřetězcové zlomy (DSB). Udržení genomové integrity je důležité pro kvalitu oocytu, fertilitu a normální embryonální vývoj. Mechanismus, jakým oocyt reaguje na přítomnost DSB, není zcela prozkoumán a zdá se, že je odlišný od somatických buněk. Domníváme se, že během meiotického zrání dochází k opravě DSB, pravděpodobně mechanismem homologní rekombinace (HR). V této práci se zaměřujeme na RAD51, esenciální rekombinázu účastnící se opravy prostřednictvím HR. Zjistili jsme, že inhibice RAD51 vede k nárůstu segregačních defektů během anafáze I. Pomocí mikroskopie živých buněk ve vysokém rozlišení jsme pozorovali výskyt chromozomálních fragmentů a anafázních můstků. Imunofluorescenční detekce ukazatele DSB γH2AX ukázala zvýšené množství DSB v profázi I a MII stádiu po inhibici RAD51. Naše data naznačují, že v profázi I a během...
|
|
|
Mechanismy reparace DNA v mechu Physcomitrella patens
Holá, Marcela ; Angelis, Karel (vedoucí práce) ; Bříza, Jindřich (oponent) ; Fajkus, Jiří (oponent)
Genomy organismů jsou během životního cyklu vystaveny působení vnějších i vnitřních chemických, fyzikálních i biologických faktorů - genotoxinů. Genotoxiny způsobují změny jak struktury DNA tak jejích základních stavebních komponent - cukerných zbytků, fosfodiesterových vazeb i purinových a pyrimidinových bází. Vzhledem k rozmanitosti a četnosti možných poškození DNA si pro udržení stability genomu organismy v průběhu evoluce vyvinuly řadu reparačních mechanismů, které jsou často propojené s dalšími buněčnými dráhami, např. přestavbou - "remodelací" chromatinu, replikací DNA, transkripcí, kontrolou buněčného cyklu či apoptózou - programovanou buněčnou smrtí (PCD). Mechanismy reparace DNA jsou zatím nejlépe prostudovány u kvasinek a savčích buněk, u rostlin však stále zbývá řadu detailů a vztahů objasnit. I přes to, že základní mechanizmy reparačních drah jsou evolučně konzervovány, jsou mezi drahami živočišných a rostlinných buněk významné rozdíly. Předkládaná disertační práce se zabývá a shrnuje výsledky zavedení rostlinného modelového organismu mechu Physcomitrella patens (Physcomitrella) a využití jeho unikátních vlastností jako je vysoká frekvence homologní rekombinace, haploidní vegetativní stav gametofytu a apikální růst filament protonemy při studiu reparace DNA. Studiem působení...
|
|
|
The functional in vitro analysis of the BRCA1alternative splicing variants
Ševčík, Jan ; Kleibl, Zdeněk (vedoucí práce) ; Stopka, Tomáš (oponent) ; Macůrek, Libor (oponent)
Úvod: Inaktivace tumor supresorového genu BRCA1 je predispozičním faktorem vzniku karcinomu prsu a ovaria. Vznik funkčně odlišných nádorově specifických alternativních sestřihových variant může být možným mechanismem snižujícím aktivitu BRCA1 v procesu reparace dvouřetězcových zlomů DNA (DDSB). V této práci jsme funkčně charakterizovali dvě alternativní sestřihové varianty BRCA114-15 a BRCA117-19, nalezené v průběhu genetického screeningu jedinců s vysokým rizikem vzniku karcinomu prsu.Metody: Pro funkční in vitro analýzu jsme vytvořili modelový systém klonů buněčné linie MCF-7 stabilně exprimujících zkoumané varianty. Pomocí comet assay a konfokální imunomikroskopie jsme v tomto systému sledovali vliv BRCA114-15 a 17-19 variant na kinetiku reparace DDSB a proliferaci. Aktivita DNA reparačních procesů byla stanovena přímo pomocí in vitro NHEJ assay a nepřímo testem senzitivity na mitomycin C. Proliferační aktivita byla stanovena klonogenním testem a růstovými křivkami. Výsledky: Exprese BRCA114-15 a 17-19 zvyšuje v MCF-7 buňkách úroveň endogenního poškození DNA, zpomaluje reparaci DDSB, negativně ovlivňuje tvorbu reparačních komplexů v počáteční fázi reparace a prodlužuje jejich trvání. Varianty BRCA114-15 a 17-19 rozdílně ovlivňují aktivitu HR, NHEJ a radiosensitivitu MCF-7 buněk. Závěr: Zvýšení exprese...
|
|
|
Geny časné meioticke profáze I spermatogeneze myši domácí
Škaloudová, Eliška ; Trachtulec, Zdeněk (vedoucí práce) ; Forman, Martin (oponent)
Meiotickým dělením vznikají gamety nutné pro reprodukci sexuálně se rozmnožujících organismů. Tato práce je zaměřena na popis genů časné fáze meiotického dělení, a to u samců modelového organismu myši domácí. První část práce souhrnně popisuje meiózu s hlubším zaměřením na profázi I, která trvá déle než profáze II. Profáze I se dělí na pět stádií, jmenovitě leptotenní, zygotenní, pachytenní, diplotenní a diakinetické. Dále je stručně popsána myší spermatogeneze a její rozdíly oproti oogenezi. Druhá část práce podává výčet genů, kódujících proteiny nutné k iniciaci meiotického dělení, k párování a synapsi a k iniciaci katalýzy dvouřetězcových zlomů. Dvouřetězcové zlomy jsou opraveny procesem homologní rekombinace, která může vyústit v tzv. crossing-over, což je hlavní zdroj genetické variability. Práce se zabývá časnou fází homologní rekombinace a složkami pro tento proces nezbytnými. Umístění meiotických dvouřetězcových zlomů v genomu není náhodné a je pod kontrolou genu Prdm9, který patrně zastává více rolí, například při vzniku nových poddruhů myši domácí. Znalost genů, kontrolujících ranou fázi meiotického dělení, je nezbytná k pochopení některých příčin neplodnosti nejen u myši, ale i u jiných obratlovců včetně člověka. Klíčová slova: meióza, myš domácí, sterilita, homologní rekombinace,...
|
|
|
Gen PALB2 a jeho úloha při vzniku karcinomu prsu.
Zdařilová, Klára ; Janatová, Markéta (vedoucí práce) ; Žáčková Suchanová, Jiřina (oponent)
Karcinom prsu je nejčastější nádorové onemocnění u žen v České republice. Mutace ve dvou hlavních predispozičních genech, BRCA1 a BRCA2, vysvětlují rozvoj onemocnění pouze u 16 % pacientů s pozitivní rodinnou anamnézou. Gen PALB2 byl objeven v roce 2006 a řadí se mezi tumor supresorové geny. Jeho proteinový produkt hraje významnou roli v opravě dvouřetězcových zlomů DNA mechanismem homologní rekombinace. Interaguje s proteiny BRCA1, BRCA2 a RAD51, umožňuje jejich vstup do reparačního ohniska a spuštění homologní rekombinace. V závislosti na poškození DNA se také podílí na regulaci buněčného cyklu. Funkce proteinu PALB2 je tedy nezbytná pro udržení integrity genomu a při její ztrátě deaktivací genu dochází ke genomové nestabilitě, která může být základem pro rozvoj tumorogeneze. Heterozygotní mutace genu PALB2 zvyšující riziko vzniku karcinomu prsu, byly také prokázány u karcinomu pankreatu a méně často u karcinomu ovaria. Proto je tedy nadějná analýza patogenních variant genu PALB2 u BRCA1/2-negativních pacientek z rodin s mnohočetným výskytem karcinomu prsu, jejíž význam může být v naší populaci srovnatelný s významem analýzy genu BRCA2.
|
|
|
Chromozomální poškození a kapacita opravy DNA v periferních lymfocytech jako ukazatelé karcinogeneze.
Kroupa, Michal ; Vodička, Pavel (vedoucí práce) ; Štětina, Rudolf (oponent)
V současné době je známo, že působení faktorů vnějšího i vnitřního prostředí buňky společně s genovými variantami modulují riziko rozvoje sporadických forem nádorů. Strukturní chromozomální aberace v periferních lymfocytech představují biomarker působení genotoxických karcinogenů a jsou považovány za indikátor zvýšeného rizika rozvoje nádorového bujení. Hlavní příčinou vzniku chromozomálních aberací jsou neopravené či chybně opravené dvouvláknové zlomy v molekule DNA; cytogenetickým měřením těchto alterací lze získat představu o tzv. "interindividuální variabilitě" v odpovědi na mutagen. Předpokládané deficience v kapacitě opravy DNA byly v této práci zkoumány u incidentních onkologických pacientů s nádory prsu, tlustého střeva a konečníku a u pacientů s nádory urogenitálního systému. Stanovení chromozomálního poškození bylo doplněno o analýzu vybraných genových variant genů účastnících se opravy poškozené DNA (XRCC3, rs861539; RAD54L, rs1048771). V této studii byla využita konvenční cytogenetická analýza a cytogenetická analýza založená na indukci chromozomálních aberací bleomycinem (tzv. "Challenge assay"), diskriminační analýza TaqMan pro stanovení alelických variant a statistická analýza. Výše uvedenými metodami nebyl prokázán statisticky významný rozdíl v průměrné hladině chromatidových zlomů...
|
host ::
RSS.