|
| |
|
|
Mechanismy reparace DNA v mechu Physcomitrella patens
Holá, Marcela ; Angelis, Karel (vedoucí práce) ; Bříza, Jindřich (oponent) ; Fajkus, Jiří (oponent)
Genomy organismů jsou během životního cyklu vystaveny působení vnějších i vnitřních chemických, fyzikálních i biologických faktorů - genotoxinů. Genotoxiny způsobují změny jak struktury DNA tak jejích základních stavebních komponent - cukerných zbytků, fosfodiesterových vazeb i purinových a pyrimidinových bází. Vzhledem k rozmanitosti a četnosti možných poškození DNA si pro udržení stability genomu organismy v průběhu evoluce vyvinuly řadu reparačních mechanismů, které jsou často propojené s dalšími buněčnými dráhami, např. přestavbou - "remodelací" chromatinu, replikací DNA, transkripcí, kontrolou buněčného cyklu či apoptózou - programovanou buněčnou smrtí (PCD). Mechanismy reparace DNA jsou zatím nejlépe prostudovány u kvasinek a savčích buněk, u rostlin však stále zbývá řadu detailů a vztahů objasnit. I přes to, že základní mechanizmy reparačních drah jsou evolučně konzervovány, jsou mezi drahami živočišných a rostlinných buněk významné rozdíly. Předkládaná disertační práce se zabývá a shrnuje výsledky zavedení rostlinného modelového organismu mechu Physcomitrella patens (Physcomitrella) a využití jeho unikátních vlastností jako je vysoká frekvence homologní rekombinace, haploidní vegetativní stav gametofytu a apikální růst filament protonemy při studiu reparace DNA. Studiem působení...
|
|
|
Produkce biologicky aktivních proteinů v rostlinách
Šmídková, Markéta ; Angelis, Karel (vedoucí práce) ; Bříza, Jindřich (oponent) ; Griga, Miroslav (oponent)
6. SOUHRN 1) Byly zavedeny tři rostlinné expresní systém umožňující produkci biologicky aktivních proteinů. První využívá dočasné exprese z vektoru dopraveného do buňky Agrobacteriem po infiltraci listů tabáku bakteriální suspenzí. Pomocí tohoto systému jsme schopni vyprodukovat množství rekombinantního proteinu dosahujícího 5% CRP během 3 dnů. Druhý expresní systém využívá suspenzní kultury stabilně transformovaného mechu Physcomitrella patens. Za kontrolovaných podmínek pěstování v bioreaktoru je výtěžek rekombinantního proteinu srovnatelný s výtěžkem z agroinfiltrace. Expresní systém využívající kombinace virové expresní kazety, založené na TRV, a jejího přenosu do rostlinné buňky pomocí Agrobacteria je pro produkční účely vzhledem k nízkým výtěžkům méně vhodný, nežli předchozí dva systémy. 2) Ve všech třech systémech lze produkovat heterologní proteiny, které se svými vlastnostmi neliší od proteinů produkovaných v původním organismu. Pro dosažení požadované aktivity heterologního proteinu produkovaného rostlinou, stejně jako pro dosažení vysokého výtěžku, je nutné provést řadu optimalizací. Významné je zjištění, že v případě virových antigenů (HPV16L1 protein) i jednořetězcových fragmentů protilátek (scFv MEM97) je pro rostlinu výhodnější exprimovat sekvence genů rekombinantních proteinů s vyšším...
|
|
| |
|
|
Mechanismy reparace DNA v mechu Physcomitrella patens
Holá, Marcela ; Angelis, Karel (vedoucí práce) ; Bříza, Jindřich (oponent) ; Fajkus, Jiří (oponent)
Genomy organismů jsou během životního cyklu vystaveny působení vnějších i vnitřních chemických, fyzikálních i biologických faktorů - genotoxinů. Genotoxiny způsobují změny jak struktury DNA tak jejích základních stavebních komponent - cukerných zbytků, fosfodiesterových vazeb i purinových a pyrimidinových bází. Vzhledem k rozmanitosti a četnosti možných poškození DNA si pro udržení stability genomu organismy v průběhu evoluce vyvinuly řadu reparačních mechanismů, které jsou často propojené s dalšími buněčnými dráhami, např. přestavbou - "remodelací" chromatinu, replikací DNA, transkripcí, kontrolou buněčného cyklu či apoptózou - programovanou buněčnou smrtí (PCD). Mechanismy reparace DNA jsou zatím nejlépe prostudovány u kvasinek a savčích buněk, u rostlin však stále zbývá řadu detailů a vztahů objasnit. I přes to, že základní mechanizmy reparačních drah jsou evolučně konzervovány, jsou mezi drahami živočišných a rostlinných buněk významné rozdíly. Předkládaná disertační práce se zabývá a shrnuje výsledky zavedení rostlinného modelového organismu mechu Physcomitrella patens (Physcomitrella) a využití jeho unikátních vlastností jako je vysoká frekvence homologní rekombinace, haploidní vegetativní stav gametofytu a apikální růst filament protonemy při studiu reparace DNA. Studiem působení...
|
|
|
Studium mechanismů rekombinace DNA u rostlin
Kozák, Jaroslav ; Angelis, Karel (vedoucí práce) ; Široký, Jiří (oponent) ; Říha, Karel (oponent)
Dvouvláknový zlom DNA (DSB) je nebezpečný typ poškození DNA, ale zároveň také slouží ke kontrolovanému zvyšování genetické variability. Za hlavní dráhy opravy DSB se považují homologní rekombinace (HR), využívající homologní sekvence, a nehomologní spojování konců DNA (C-NHEJ). Dva rostlinné modely Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) a mech Physcomitrella pattens (Physcomitrella) se liší strategií opravy DSB. Arabidopsis dává přednost C-NHEJ a Physcomitrella zase HR. Tyto modelové rostliny jsou porovnány na základě měření kinetiky opravy DSB a jednovláknových zlomů DNA (SSB) kometovým testem. U obou rostlinných druhů je poločas první rychlé fáze opravy DSB kolem 5 minut. I když je C-NHEJ považována za hlavní dráhu opravy DSB u Arabidopsis, rychlá oprava není závislá na jejích faktorech AtKu80 a AtLIG4, což poukazuje na existenci efektivních záložních nehomologních drah (A-NHEJ). U Physcomitrella dominuje rychlá oprava DSB v mitoticky aktivních buňkách a také není závislá na PpLIG4. Naopak PpLIG4 se překvapivě účastní opravy alkylačního poškození DNA. Esenciální ligázou rychlé opravy DSB u Arabidopsis je replikační AtLIG1, která je také zodpovědná za opravu alkylačního poškození DNA, a tak představuje funkční homolog LIG3. Rychlá oprava DSB je také zcela závislá na AtSMC6b, který patří do skupiny...
|
|
| |
|
|
Produkce biologicky aktivních proteinů v rostlinách
Šmídková, Markéta ; Angelis, Karel (vedoucí práce) ; Bříza, Jindřich (oponent) ; Griga, Miroslav (oponent)
6. SOUHRN 1) Byly zavedeny tři rostlinné expresní systém umožňující produkci biologicky aktivních proteinů. První využívá dočasné exprese z vektoru dopraveného do buňky Agrobacteriem po infiltraci listů tabáku bakteriální suspenzí. Pomocí tohoto systému jsme schopni vyprodukovat množství rekombinantního proteinu dosahujícího 5% CRP během 3 dnů. Druhý expresní systém využívá suspenzní kultury stabilně transformovaného mechu Physcomitrella patens. Za kontrolovaných podmínek pěstování v bioreaktoru je výtěžek rekombinantního proteinu srovnatelný s výtěžkem z agroinfiltrace. Expresní systém využívající kombinace virové expresní kazety, založené na TRV, a jejího přenosu do rostlinné buňky pomocí Agrobacteria je pro produkční účely vzhledem k nízkým výtěžkům méně vhodný, nežli předchozí dva systémy. 2) Ve všech třech systémech lze produkovat heterologní proteiny, které se svými vlastnostmi neliší od proteinů produkovaných v původním organismu. Pro dosažení požadované aktivity heterologního proteinu produkovaného rostlinou, stejně jako pro dosažení vysokého výtěžku, je nutné provést řadu optimalizací. Významné je zjištění, že v případě virových antigenů (HPV16L1 protein) i jednořetězcových fragmentů protilátek (scFv MEM97) je pro rostlinu výhodnější exprimovat sekvence genů rekombinantních proteinů s vyšším...
|
|
|
Využití rostlin k produkci protilátek
Angelis, Karel ; Šmídková, Markéta
Rostliny jsou nejstarším biotechnologickým produkčním systémem a jako eukaryotní organismy jsou schopny produkovat modifikované proteiny. Využívají se laboratorní modelové rostliny jako tabák nebo produkční plodiny s vypracovou logistikou sklizně a skladování jako je brambor a rýže. Perspektivní jsou kapalné kultury unožňující kultivací za kontrolovaných podmínek. Např. mech Physcomitrella patens kromě pěstování v kapalné kultuře díky vysoké účinnosti homologní rekombinace umožňuje cílenou modifikací (gene targeting) rekonstruovt glykosylační dráhy tak, aby odpovídala lidským. Pro heterologní expresi v rostlinách se konstruují rekombinantní protilátky, kdy se pro plně funkční jednořetězcovou scFv se z původní protilátky využívá pouze variabilní konce lehkého VL a těžkého VH řetězce, které vytváří vazebné místo. Rekombinantní scFv protilátky jsou využívány pro terapii a diagnostiku různých nádorových onemocnění.
|
host ::
RSS.