|
|
Měření vnitrobuněčné koncentrace iontů v mikroorganismech
Vodáková, Adéla ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Diplomová práce se zabývá měřením vnitrobuněčné koncentrace iontů v bakteriích Escherichia coli a kvasinkách Saccharomyces cerevisiae pomocí geneticky kódovaných fluorescenčních sond obsahujících zelený fluorescenční protein (GFP). V úvodu práce shrnuji známé poznatky o tomto proteinu a jeho spektrálních charakteristikách. Pro experimentální část práce byl vybrán senzor reagující na změny pH ve svém okolí změnou poměru intenzity fluorescence dvou pásů v excitačním spektru - poměrový pHluorin. Tato sonda byla otestována jak v bakteriálních, tak v kvasinkových buňkách. Byla sledována schopnost mikrobiálních buněk udržovat si stálou hodnotu cytosolického pH při odlišných vnějších podmínkách, jako je různé pH suspenze, přidání glukózy či KCl do suspenze. V práci je dále řešen problém odstranění příspěvku autofluorescence buněk ze signálu GFP při kalibraci a následném měření vnitrobuněčného pH. Úspěšně byla použita metoda synchronně skenované fluorescence pro potlačení nechtěných příspěvků. Při použití této metody navíc dochází k vylepšení poměru signálu k šumu a tím k zpřesnění odečítaných hodnot cytosolického pH.
|
|
| |
|
|
Ontogenetický původ chrupavčitých elementů lebky axolotla
Kloučková, Lenka ; Černý, Robert (vedoucí práce) ; Roček, Zbyněk (oponent)
Ačkoliv některé aspekty jednotlivých studií se liší, je všeobecně přijímán fakt, že chrupavčité elementy viscerokrania obratlovců mají svůj původ v buňkách neurální lišty. Ve své práci upřesňuji tento fakt na modelovém živočichovi Ambystoma mexicanum na základě isotopických a isochronických transplantací prekurzorů neurální lišty - neurálních valů, případně již uzavřené neurální trubice před odmigrováním buněk. Celkem jsem pro svůj výzkum provedla 179 transplantací. Analyzovala jsem poté 67 embryí ve stadiích 40-42 a 7 larev o délce 15-19 mm. Touto moderní metodou prokazuji, že ventro-kaudální element viscerokrania nemá původ v neurální liště. Dále potvrzuji a upřesňuji, ze které anterio-posteriorní úrovně neurálních valů, případně rhombomer zadního mozku vznikají jednotlivé proudy neurální lišty a následně viscerální chrupavky axolotla. Jeden z elementů, basibranchiale 1, má dokonce dvojí původ. Uvádím a diskutuji zde také některé další deriváty hlavové neurální lišty jako například mezenchym hlavy a vnějších žaber, trabekuly, část otické kapsule nebo pojivové tkáně v hlavě.
|
|
|
Optimalizace kultivačního média HEK293 buněčné linie
Čuperková, Romana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
HEK293 je lidská buněčná linie odvozená z embryonálních buněk ledvin a je často využívaným systémem pro výrobu rekombinantních proteinů. Tato práce se zabývala optimalizací složení bezsérového média pro HEK293S a HEK293T linie za účelem náhrady drahých komerčních médií. Indikátorem byl růst kultury a exprese reportérových proteinů SEAP a GFP. Podařilo se mi vytvořit nové médium, které mimo jiné obsahovalo insulin (1 mg/l), transferin (5 mg/l) a směs stopových prvků. Při kultivaci ve směsi komerčního média EX-CELL 293 s mým novým médiem se buňky linie 293S množily rychleji než v komerčních médiích (doba zdvojení 20,47 ± 2,68 hodin (srel = 13,1 %)). Zdá se, že je nové médium vhodné také pro transfekci HEK293 linií a poskytuje relativně vysokou expresi rekombinantních proteinů. Transfekční poměr DNA:PEI (w/w) pro toto médium je 1:2 až 1:3.
|
|
|
Studium exprese jaderného receptoru nhr-97 v Caenorhabditis elegans
Boušová, Kristýna ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Jaderné hormonální receptory (NHR) patří mezi důležité transkripční faktory, které regulují vývoj a metabolismus u velké části živočichů. Caenorhabditis elegans obsahuje 284 jaderných receptorů, což je neobvykle velké množství oproti receptorům nalezeným u Drosophila melanogaster (18) a u člověka (48). Patnáct z těchoto receptorů C. elegans má homologní strukturu s receptory D. melanogaster a se savci. Zbylých 269 NHR jsou specifické pouze pro hlístice a patří do skupiny tzv. doplňkových jaderných receptorů (SupNRs), jejichž evolučním předchůdcem je HNF4 - důležitý transkripční faktor u člověka. V této práci jsme popsali jaderný hormonální receptor nhr-97, jehož exprese a funkce dosud nebyly studovány. Gen je kódován v genomu C. elegans a patří mezi SupNRs. Nhr-97 tvoří dvě isoformy A a B, jejichž exprese je v tkáních C. elegans odlišná. Lokalizace exprese genu in vivo byla určena pomocí transgenních linií exprimujících nhr-97::GFP. Pro isoformu A byla exprese nhr-97 lokalizována v neuronech v oblasti hltanu a v oblasti ocásku, ve střevě a v hypodermis, pro isoformu B v hltanu, v neuronech okolo korpusu hltanu, v hlavové mesodermální buňce a v análním svěrači. Exprese nhr-97 během vývoje C. elegans byla stanovena pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR). Zjistili jsme, že mRNA...
|
|
|
Optimalizace rekombinantní exprese proteinů v HEK293 buněčné linii
Bláha, Jan ; Šácha, Pavel (oponent) ; Bezouška, Karel (vedoucí práce)
Savčí buňky jsou dominantním systémem pro rekombinantní expresi farmaceutických proteinů. S rozvojem metodiky transientní transfekce savčích buněk se tento systém stává vhodným také pro strukturní biologii. Tato práce se zabývala optimalizací rekombinantní exprese v buněčných liniích HEK293T a HEK293-6E v různých médiích za použití snadno stanovitelných reportérových proteinů - sekretované alkalické fosfatasy (SEAP) a zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Důraz byl kladen na optimalizaci klíčových faktorů tvorby transfekčního komplexu - poměru DNA a polyethyleniminu a množství vložené DNA. Sledován byl i pozitivní vliv inhibitoru histonových deacetylas kyseliny valproové a dále kaseinového hydrolyzátu Tryptone N1.
|
|
|
Studium vlastností membránového napěťového senzoru ASAP1 exprimovaného v buněčné linii HEK 293
Sanetrníková, Dominika ; Chmelíková, Larisa (oponent) ; Svoboda, Ondřej (vedoucí práce)
Tato práce se v úvodu věnuje seznámení s plasmidovou DNA, která se v podobě vektoru využívá v molekulární biologii. Ve formě fluorescenčních sond lze plasmidy využít pro měření změn membránového potenciálu. Do jejich struktury se přidává barvivo fluorofor. Důležitým zástupcem této práce je fluorescenční sonda ASAP1, která obsahuje zelený fluorescenční protein, jehož reakcí na změnu membránového potenciálu je pokles intenzity emitovaného světla. Cílem práce bylo provést chemickou transfekci tohoto plasmidu do buněčné linie HEK293 a provést jeho charakterizaci. V práci je rovněž navržena metoda pro analýzu časového průběhu změn fluorescence v závislosti na depolarizaci buněčné membrány. V závěru práce je popsán uskutečněný experiment včetně diskuze získaných výsledků.
|
|
|
Vizualizace značených buněk modelového organismu
Kubíček, Radek ; Kršek, Přemysl (oponent) ; Herout, Adam (vedoucí práce)
Tato diplomová práce, zabývající se zobrazením volumetrických (objemových) dat, má za úkol zobrazit a zvýraznit značené buňky modelových organismů v datech sejmutých konfokálním mikroskopem. Vstupní data tvoří jednolitý volumetrický celek složený z jednotlivých řezů, který je nutno vhodnou metodou zobrazit a poté identifikovat a zvýraznit buňky označené metodou GFP (Green Fluorescent Protein) nebo fluoreskováním chlorofylu. Hlavním cílem této práce je nalézt pokud možno optimální efektivní metodu umožňující toto zvýraznění, pracující ideálně bez manuálního zásahu uživatele. Vzhledem ke struktuře dat je však tento cíl jen těžko splnitelný, proto postačí nalezení metody operující v manuálním režimu. Nakonec je třeba dosažené výsledky práce zaintegrovat do nástroje FluorCam pro zobrazování dat z dekonvolučního konfokálního mikroskopu.
|
|
|
Reportéry genové exprese u \kur{Drosophila melanogaster}.
ŠTROS, Jiří
Drosophila melanogaster je široce používaný modelový organismus v genetice a v dalších disciplínách souvisejících s lékařsky a biotechnologicky významnými problémy. První část práce podává přehled některých základních genetických nástrojů a reportérů genové exprese používaných při práci s D.melanogaster s důrazem na reportérový gen GFP. Druhá část podává popis a výsledky experimentální práce zaměřené na reportérový konstrukt sestávající z genu adenosin deaminasy (ADGF-A) a značky GFP. Při práci s reportéry genové exprese, jako je GFP, je důležité vědět, zda přítomnost reportéru neovlivňuje studovaný proces. Experiment popsaný v této práci testoval, zda je fúzní protein sestávající z adenosin deaminasy a GFP plně funkčním enzymem, nebo zda je aktivita enzymu ovlivněna přítomností fluorescenční značky. Výsledky práce podporují vhodnost fúzního konstruktu jako reportéru genové exprese.
|
|
| |
host ::
RSS.