|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Charakterizace rekombinantní myší glutamátkarboxypeptidasy III
Janoušková, Karolína ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, PSMA, NAALADasa) je transmembránová metalopeptidasa a díky štěpení specifických substrátů β-citryl-L-glutamátu (BCG), N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamátu (NAAG) a polyglutamylovaných folátů (Pte-Glun) je studována jako potenciální terapeutický cíl. Enzymy, které by mohly kompenzovat enzymovou aktivitu a funkce GCPII, jsou proto rovněž relevantními cíli enzymologického výzkumu. Jedním z homologů GCPII s podobnou enzymovou aktivitou je glutamátkarboxypeptidasa III (GCPIII, NAALADasa II). U rekombinantní myší GCPIII ještě nebyly stanoveny kinetické parametry KM a kcat popisující její aktivitu. Myší GCPIII je důležité kineticky charakterizovat a porovnat s lidským ortologem, aby bylo zjištěno, jestli je enzymová aktivita tohoto enzymu v myším modelu srovnatelná se situací u člověka. Rekombinantní myší GCPIII byla kineticky charakterizována. Kinetické parametry rekombinantní myší GCPIII pro substráty NAAG a BCG byly změřeny metodou štěpení radioaktivně značeného substrátu. Kinetika reakce pro substrát Pte-Glu2 byla analyzována pomocí HPLC. Z hlediska štěpení NAAGu je lidská GCPIII účinnější než myší ortolog, v případě substrátu BCG jsou enzymy srovnatelné. Tyto výsledky nás posunou blíže k pochopení role GCPIII v nejpoužívanějším zvířecím modelu. Klíčová slova:...
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Deriváty protilátek využitelné k detekci lidské glutamátkarboxypeptidasy II
Bělousová, Nikola ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Rakovina prostaty je jedním z nejzávažnějších rakovinných onemocnění na světě, a proto je velmi důležitý vývoj vhodných diagnostických a terapeutických postupů. Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII) je v současné době posuzována jako jeden z nejzajímavějších markerů rakoviny prostaty díky své tkáňově specifické expresi. Zatímco ve zdravé tkáni prostaty se vyskytuje mizivé množství tohoto proteinu, spolu se vznikem nádoru se výrazně zvyšuje produkce GCPII v transformovaných buňkách. Množství GCPII v rakovinné tkáni dále stoupá spolu se vzrůstající invazivitou nádoru, proto je GCPII vhodný marker pro časná i pokročilá metastazující stadia rakoviny prostaty. Současný výzkum se zaobírá vývojem látek dostatečně citlivých a specifických pro detekci malého množství GCPII, například v počátečních stadiích rakoviny. Deriváty protilátek se ukazují jako molekuly vhodné pro tento účel, neboť vykazují vysokou afinitu a specificitu a minimální nežádoucí vedlejší účinky. Proteinové inženýrství umožňuje přípravu celé řady protilátkových molekul lišících se svou velikostí, vazebnými vlastnostmi, stabilitou a rozpustností a způsobem produkce. Odlišné deriváty jsou vyvíjeny pro účely diagnostické a terapeutické a pro zobrazovací techniky, pro které jsou vhodné molekuly o střední až malé velikosti. Jedním typem těchto...
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Novák, Petr (oponent)
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Glutamate Carboxypeptidase II as a Drug Target and a Molecular Address for Cancer Treatment
Knedlík, Tomáš ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Stiborová, Marie (oponent) ; Souček, Pavel (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII), známá také jako membránový antigen specifický pro prostatu (PSMA), je membránová metalopeptidasa, jež je exprimovaná na buňkách karcinomu prostaty. GCPII si dále získala pozornost neurologů, neboť v mozku štěpí neurotransmiter N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamát (NAAG). Touto aktivitou se GCPII může podílet na řadě mozkových poruch, jelikož NAAG vykazuje neuroprotektivní účinky. GCPII se proto stala prostředkem pro zobrazování a možnou cílenou léčbu nádorů prostaty stejně jako pro léčbu mozkových poruch. Nádory prostaty celosvětově představují druhé nejčastější mužské nádorové onemocnění. U většiny mužů, dříve či později, dochází k vytvoření určité formy nádoru prostaty. Nádory prostaty jsou ovšem život ohrožující pouze při opuštění samotné prostaty a rozšíření do jiných tkání. Z tohoto důvodu bylo enormní úsilí vloženo do dřívější detekce nádorů v lépe léčitelných stupních, stejně jako do cílení na agresivní metastatické nádory resistentní na standardní léčbu. Pacienti procházející konvenční terapií (kombinace chemoterapie a chirurgického zákroku) trpí poměrně závažnými vedlejšími účinky - proto jsou hledány účinnější způsoby léčby zahrnující selektivní směrování na nádorové antigeny, jež jsou mnohonásobně více produkovány nádorovými buňkami. GCPII představuje tento cíl,...
|
|
|
Vliv iontu Ca2+ na aktivitu lidské glutamátkarboxypeptidasy II.
Nedvědová, Jana ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Lidská glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, EC 3.4.17.24) je homodimerní membránový glykoprotein, který slouží jako marker rakoviny prostaty a rovněž jako terapeutický cíl léčby neurodegenerativních onemocnění. Extracelulární část GCPII je složená z apikální, proteasové a C-koncové domény. V aktivním místě jsou přítomny dva zinečnaté ionty nezbytné pro enzymatickou aktivitu. V blízkosti dimerizačního rozhraní je pak mezi apikální a proteasovou doménou koordinován ion Ca2+ , který je od aktivního místa vzdálen 20 Å, a tudíž se pravděpodobně přímo neúčastní hydrolýzy substrátů. Předkládaná práce si klade za cíl objasnit funkci iontu Ca2+ v molekule GCPII s využitím kombinace molekulárně- biologických, biochemických a biofyzikálních přístupů. Za tímto účelem jsme připravili sérii rekombinantních proteinů s bodovými mutacemi aminokyselin koordinujících Ca2+ ion. Mutantní proteiny byly exprimovány v hmyzích S2 buňkách a purifikovány pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie. Tyto proteiny vykazovaly výrazně sníženou enzymatickou aktivitu, nižší teplotní stabilitu a zvýšenou tendenci k tvorbě nefyziologických agregátů a naopak monomerní formy GCPII. Z výsledků tedy vyplývá, že ion Ca2+ hraje zásadní roli pro správné sbalování GCPII a rovněž pro tvorbu homodimerů, které jsou fyziologickou a hydrolyticky...
|
|
|
Chemically modified Murine Polyomavirus-like particles and their interaction with Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA)
Blažková, Kristýna ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Horníková, Lenka (oponent)
Rakovina prostaty patří mezi nejčastější nádorová onemocnění u mužů a je tedy velká poptávka po cílené léčbě. V této diplomové práci popisuji využití Glutamát karboxypeptidázy II (GCPII) jako vhodného cíle pro možné cílení. GCPII je transmembránový protein, který internalizuje po navázání ligandu, a jeho exprese v nádorech prostaty je významně zvýšená. Virům-podobné částice z myšího polyomaviru (VLPs) jsou vhodným nosičem pro vizual- izaci a léčbu. Zde popisuji modifikace VLPs inhibitory GCPII a charakterizaci jejich vazby na GCPII pomocí povrchové plasmonové rezonance a vazby na buňky exprimující GCPII pomocí konfokální mikroskopie. VLPs s inhibitory GCPII vykazují specifickou vazbu GCPII na povrchové plasmonové re- zonanci, bohužel se tato specificita ztrácí při vazbě na buňky. Jedním přístupem, jak tuto ne- specifitu odstranit, byla substituce v BC smyčce kapsidového proteinu VP1 na vnějším povrchu VLPs, která by měla být spoluodpovědná za vazbu kyseliny sialové. Tato substituce však neomezila nespecifitu částic. Dalším testovaným přístupem bylo obalení VLPs velkými poly- mery nesoucími fluorescenční značku i inhibitor GCPII. Po obalení VLPs vykazovaly tyto čás- tice v předběžných experimentech specifickou vazbu a internalizaci v buňkách exprimujících GCPII. Tyto výsledky...
|
|
|
Evaluation of the properties of polymer conjugates which specifically bind proteins and can be used in molecular biology
Parolek, Jan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Liberda, Jiří (oponent)
V posledních třech desetiletích bylo vloženo značné úsilí do vývoje polymerních konjugátů nízkomolekulárních léčiv. Hlavním důvodem této snahy byla skutečnost, že vytvořené makromolekulární konjugáty mají nejen výhodnější distribuční profil než původní nízkomolekulární léčivo. Při konjugaci má zásadní roli molekulární spojka mezi páteří polymeru a léčivem: spojku je možné vytvořit buď enzymaticky rozložitelnou, nebo odolnou vůči degradačním enzymům. Výběr správného polymerního nosiče je taktéž klíčový, neboť musí splňovat přísné požadavky na biokompatibilitu. Vzniklé makromolekulární konjugáty mají tendenci se akumulovat v solidních nádorech díky efektu nazývanému EPR ("Enhanced Permeability and Retention" efekt). V praxi existuje řada možností využití makromolekulárních konjugátů nízkomolekulárních léčiv. V úvodu této práce jsem shrnul různé práce o kopolymerech poly(N-(2-hydroxypropyl)metakrylamidu (HPMA). V této části práce jsem též stručně představil proteiny experimentálně používané v terapii. Vyvinuli jsme HPMA kopolymery obsahující cílící ligand (inhibitor), afinitní kotvu (biotin) a signalizační prvek (fluorescenční skupina). Pro testování našich HPMA kopolymerů jsme vybrali následující terapeuticky významné proteiny: glutamátkarboxypeptidasa II (membránový marker karcinomu prostaty), HIV-1...
|
|
|
Příprava a charakterisace rekombinantního dermcidinu jako potenciálního proteinového partnera glutamátkarboxypeptidasy II
Tužil, Jan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proces novotvorby cévního zásobení je klíčový pro růst a přežití jakéhokoliv pevného nádoru. Zatímco většina nádorů zůstává nevaskularizována a zpravidla nepřesáhne svou velikostí několik milimetrů, některé novotvary prochází tzv. angiogenním přechodem, v důsledku čehož začne docházet tvorbě krevních tělísek. Počet buněk podstupujících apoptosu se snižuje a nádor se začíná rozrůstat. Je známo několik dobře prostudovaných faktorů, jež ovlivňují fyziologické děje spojené s novotvorbou cév. Tyto látky se mohou, ale nemusí vyskytovat i v tkáních nádoru. Glutamátkarboxypeptidáza II (GCPII; EC 3.4.17.21) je transmembránový glykoprotein II. typu, u něhož byly objeveny dvě fyziologicky významné enzymatické aktivity. GCPII je exprimována ve vaskulatuře pevných nádorů, přičemž zde však nebyla pozorována žádná funkce spojená s těmito aktivitami. Přestože se spekuluje o možné receptorové funkci GCPII, přirozený ligand dosud nebyl identifikován. Předcházející experimenty v naší laboratoři naznačily možnost interakce některých proteinů s GCPII. Jeden z nich- dermcidin byl vybrán jako možný vazebný partner, byl naklonován, exprimován v savčích buňkách a poté byla prověřena jeho možná interakce s GCPII pomocí nového detekčního systému využívajícího kotvu FLAG. Interakci in vitro se však nepodařilo potvrdit ani vyvrátit.
|
host ::
RSS.