|
|
Intermediate filament proteins of Preaxostyla flagellates
Švagr, Ezra ; Hampl, Vladimír (vedoucí práce) ; Varga, Vladimír (oponent)
6 Abstrakt Monocercomonoides exilis a Paratrimastix pyriformis jsou protista ze skupiny Preaxostyla (Excavata), mají exkavátní morfologii, která se považuje za ancestrální formu cytoskeletální organizace eukaryotických buněk. Podstatnou částí této morfologie jsou vlákna složená z dosud neidentifikovaných proteinů. Tato práce staví na teorii, že tyto vlákna jsou složena z proteinů Intermediárních filament (IF proteinů). IF proteiny jsou polyfyletická skupina proteinů, která se podílí na tvorbě mechano-elasticky významných vláken v eukaryotických buňkách. Nejvíce rozšířenou skupinou těchto proteinů jsou SF-assembliny, homology těchto proteinů byly poprvé popsány u druhu Chlamydomonas reinhardii, giardiny, proteinová rodina poprvé popsaná u Giardia intestinalis, jsou také příbuzné s těmito proteiny. Identifikace SF-assemblinů e u M. exilis a P. pyriformis by dále upevnila pozici SF-assemblinů jako obecně přítomného proteinu v eukaryotickém cytoskeletu. Cílem této práce bylo studovat proteiny přítomné v cytoskeletu exkavát dvěma způsoby. Zaprvé identifikovat proteiny v obohacené cytoskeletální frakci získané z kultur M. exilis a P. pyriformis. Zadruhé, lokalizovat SF-assembliny v obou protistech pomocí protilátek a expanzní mikroskopie. Protokol pro expanzní mikroskopii byl optimalizován pro oba organismy. V...
|
|
|
Cytoskeletal orchestration of early mammalian development
Novotný, Jan ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Mašek, Jan (oponent)
Struktury cytoskeletu hrají klíčovou úlohu v raném savčím embryonálním vývoji. Mnohé práce ukázaly, že mikrotubuly, intermediární filamenta i aktinová mikrofilamenta jsou důležitým strukturním i funkčním prvkem všech hlavních událostí časné preimplantační ontogenese. Během procesu polarizace se mikroklky vyztužené svazky aktinových filament přesouvají k jednomu pólu blastomery. Další významné změny prodělávají složky cytoskeletu v období kompakce embrya. Buňky adherují k okolním, zplošťují se díky kontrakcím komplexů aktinu a myosinu nebo tvorbě mezibuněčných spojů. Blastomery také vytváří filopodia, výběžky plasmatické membrány obsahující aktinová filamenta. Tyto struktury jsou zmiňovány pro svou úlohu v přibližování povrchů blastomer během embryonální kompakce nebo možnou roli v mezibuněčné signalizaci. Prvním procesem specifikace v raném savčím vývoji je rozlišení mezi zevními buňkami moruly, které se stávají presumptivním trofektodermem a vnitřními buňkami, budoucí vnitřní buněčnou masou embrya. Proteiny i struktury cytoskeletu jsou asymetricky distribuovány mezi tyto dvě buněčné populace a pomáhají tak určit vývojový osud každé blastomery. Tato práce si klade za cíl shrnout úlohy cytoskeletu v polarizaci blastomer, kompakci embrya a specifikaci vnitřní a zevní buněčné populace v průběhu...
|
|
|
Charakterizace centrinů Euglena gracilis a jejich úloha v metabolii
Šmída, Adam ; Hampl, Vladimír (vedoucí práce) ; Pergner, Jiří (oponent)
Euglena gracilis je jednobuněčný volně žijící sladkovodní bičíkovec řadící se do třídy Euglenida (Euglenozoa, Discoba, Excavata). Synapomorfií skupiny Euglenida je jejich pelikula, pevná vrstva pod povrchem buňky, strukturovaná do tenkých proteinových pruhů zvaných pelikulární stripy, které jsou do sebe zakleslé a probíhají pod plazmatickou membránou po celém povrchu buňky. U E. gracilis jsou tyto stripy schopné se navzájem paralelně posouvat, tím dochází ke kontrakci měnící tvar buňky, což vytváří pro eugleny charakteristický peristaltický pohyb zvaný metabolie. Mechanismus tohoto pohybu není objasněn, předpokládá se ale, že se síla generuje v oblasti pod pelikulárním stripem, kde se nachází různé cytoskeletární komponenty jako mikrotubuly či jiná dosud nespecifikovaná cytoskeletární vlákna. Tato práce testuje hypotézu, že za pohybem pelikuly stojí kontrakce pomocí centrinů. Tyto malé proteiny schopné vázat vápenaté ionty jsou evolučně velmi konzervované a účastní se mnoha procesů v eukaryotických buňkách. Mohou být právě také součástí různých kontraktilních struktur protist jako například u nálevníků rodu Vorticella či Paramecium. V transkriptomu E. gracilis byly vyhledány sekvence centrinů a v porovnání s dostupnými daty proteomů pelikuly byl nalezen jediný kandidát. Tento centrin byl úspěšně in...
|
|
|
Cellular determinants of the distribution of PIN auxin transporters in the plasma membrane
Stelate, Ayoub ; Petrášek, Jan (vedoucí práce) ; Mravec, Jozef (oponent) ; Nodzynski, Tomasz (oponent)
Asymetrická lokalizace přenašečů auxinu vždy přitahovala pozornost mnoha vědců po celém světě. Zabývat se tímto tématem se zaměřením na plazmatickou membránu (PM) však vyžaduje pokročilé mikroskopické techniky a znalosti biofyziky a biologie. Tato doktorská práce propojuje tyto dvě disciplíny aby přispěla k našemu pochopení dynamiky a distribuce přenašečů auxinu PIN-FORMED z tabáku (NtPINs) v PM. Vyvinul jsem novou metodu korelační světelné a elektronové mikroskopie (CLEM) s využitím fluorescenční mikroskopie s totálním vnitřním odrazem (TIRFM) a pokročilé environmentální skenovací elektronové mikroskopie (A- ESEM). Pokud je mi známo, jedná se o první pokus o dosažení korelace mezi imunofluorescenčním a elektronovým mikroskopickým zobrazením integrálních PM proteinů u rostlin. Jak jsem ukázal, jednotlivé NtPINs jsou v PM uspořádány různě. Dynamické analýzy, které kvantifikují rychlost difuze jednotlivých nanodomén, mi umožnily ukázat, že NtPINs mají do různí míry omezenou pohyblivost a jejich rychlost difúze se liší. Zkoumal jsem roli buněčné stěny a cytoskeletu v organizaci a dynamice NtPINs. Pomocí farmakologického ošetření jsem ukázal, že rozdílně ovlivňují jejich mobilitu a organizaci v PM, kdy úplné odstranění buněčné stěny vykazuje významné změny v distribuci nanodomén NtPINs ve srovnání s...
|
|
|
LINC complex: The link between chromatin integrity and sperm motility
Šanovec, Ondřej ; Komrsková, Kateřina (vedoucí práce) ; Lánská, Eva (oponent)
LINC komplex (z angl. Linker of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton) je multiproteinová struktura nacházející se v jaderné membráně, která propojuje cytoskelet s jaderným skeletem. Jedná se o velmi konzervovaný komplex, který se nachází v každé savčí buňce, včetně gamet. Zde je ovšem LINC komplex velice variabilní a sestává se z různých proteinových partner, které mají specifickou lokalizaci. Zároveň se jedná o oblast, oproti somatickým buňkám, málo prozkoumanou. Tato práce se zabývá rolí LINC komplexu během spermiogeneze na myších modelech. Použit byl divoký typ a myší linie s delecí Protaminu 2 (Prm2-/- ). Protaminy jsou male proteiny, které nahrazují histony během spermiogenese. Myší model použitý v této studii, vytvořený týmem profesora Huberta Schorle, má deleci v exonu 1 genu Prm2. Důsledkem této delece mají takto ovlivněné myši překvapivý fenotyp, který zahrnuje úplnou ztrátu motility spermií. Na základě těchto pozorování byla vytvořena hypotéza, že LINC komplex může být zodpovědný za špatnou komunikaci mezi hlavičkou a bičíkem spermie, což vede ke ztrátě pohyblivosti. Výsledky ovšem naznačují, že LINK komplex není ztrátou Prm2 ovlivněn. Získaná data ovšem naznačují, že by v Prm2-/- spermiích mohla být narušena dynamika aktinu, aktivita cytoskeletálních motorů nebo tubulin acetylázy / histon...
|
|
|
Mechanizmus chybného formování spojení hlavičky a bičíku u acefalických spermií s nedostatečnou tvorbou centrobinu
Vlčková, Monika ; Frolíková, Michaela (vedoucí práce) ; Krejčová, Tereza (oponent)
Syndrom acefalických spermií (ASS) je vzácnou formou teratozoospermie, která je pravděpodobně genetického původu. Spermie jedinců s tímto syndromem mají poškozený aparát spojující hlavičku a bičík (HTCA), což vede ke vzniku acefalických spermií tzn. spermií s oddělenými hlavičkami od bičíků. Jedinci postižení ASS jsou téměř výhradně neplodní. Jedním z proteinů, jehož mutace způsobuje ASS, je SUN5. Proteiny SUN jsou společně s KASH proteiny součástí tzv. LINC komplexu, který zajišťuje spojení nukleoskeletu s cytoskeletem. Centrobin je protein podílející se na duplikaci centriol a sestavení dělícího vřeténka. Potkani nesoucí poškozený gen pro Centrobin mají sníženou fertilitu a vykazují fenotyp ASS. Z toho důvodu byl tento modelový organismus v této práci využit pro studium možných vzájemných vazeb proteinů podílejících se na vzniku ASS. Vzhledem k podobnému fenotypu spermií s mutovaným centrobinem a SUN5, existuje možnost, že centrobin interaguje s některým z proteinů LINC komplexu a společně se podílejí na vytvoření spojení hlavičky a bičíku. Spermie potkanů s poškozeným genem pro Centrobin vykazují rovněž značné poškození bičíků. U pacientů s ASS byla dříve popsána snížená exprese proteinu Odf1 a myší Odf1-deficientní samci jsou neplodní v důsledku dekapitace. V této práci jsme se proto zaměřili i...
|
|
|
Role aktinového cytoskeletu při umisťování auxinových přenašečů v plazmatické membráně.
Kebrlová, Štěpánka ; Petrášek, Jan (vedoucí práce) ; Pernisová, Markéta (oponent)
Auxin hraje významnou morfogenní roli ve vývoji rostlin, zejména díky jeho účinku na genovou expresi, ale i řadu rychlejších dějů, které jsou přímo závislé na jeho koncentraci. Proto je v mnoha rostlinných pletivech směrovaný transport auxinu, zajišťovaný specifickými přenašeči v plazmatické membráně, důležitý pro koordinaci morfogenních stimulů. Množství auxinových přenašečů v plazmatické membráně přímo ovlivňuje výslednou koncentraci auxinu uvnitř buňky. Ačkoliv se dá předpokládat, že lokalizace auxinových přenašečů a jejich množství v plazmatické membráně jsou určovány především aktinovým cytoskeletem a jeho zapojením v procesech váčkového transportu, není v současné době tento vztah stále vyjasněn. Proto nás v této práci zajímalo, jak je lokalizace a funkce auxinových přenašečů ovlivněna v případě, že je v daném buněčném typu postižena funkce aktinového cytoskeletu. K tomuto účelu byla studována lokalizace auxinových přenašečů PIN3, PIN4, PIN7 a AUX1 v pokožkových buňkách velmi mladých děložních listů Arabidopsis thaliana, jejichž morfogeneze byla postižena mutacemi v podjednotkách aktinového nukleačního komplexu ARP2/3. Byly připraveny kříženci mutantů v podjednotkách komplexu ARP2/3 s markerovými liniemi nesoucí fluorescenčně označené auxinové přenašeče a sensory auxinem řízené genové...
|
|
|
Role posttranslačních modifikací tubulinu v regulaci mikrotubulárních procesů
Šliková, Pavlína ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Libusová, Lenka (oponent)
Mikrotubulární cytoskelet hraje zásadní roli v nejrůznějších buněčných pochodech, jako je vnitrobuněčný transport, buněčná motilita či segregace chromosomů při buněčném dělení. Tubulin, stavební jednotka mikrotubulů, prochází mnohými posttranslačními modifikacemi, které ovlivňují dynamiku mikrotubulů, jejich organizaci a interakci s dalšími proteiny. Porozumění tomu, jakou roli posttranslační modifikace hrají v zajištění rozmanitých funkcí a vlastností mikrotubulů, je klíčové k pochopení dynamiky mikrotubulárního cytoskeletu jako celku. Přesné mechanismy, jakými posttranslační modifikace na mikrotubulární cytoskelet působí, však nejsou zcela objasněny. V této práci byl zkoumán vliv přítomnosti posttranslačních modifikací na růst mikrotubulů a na jejich interakci s motorovým proteinem kinesinem-1. Pomocí fluorescenční mikroskopie s úplným vnitřním odrazem a interferenční reflekční mikroskopie bylo zjištěno, že vysoká míra posttranslačních modifikací na mikrotubulech snižuje délku jejich interakce s kinesinem, zatímco afinita kinesinu k mikrotubulům a průměrná rychlost, kterou se po nich pohybuje, se u vysoce a málo modifikovaných mikrotubulů významně neliší. Dále bylo zjištěno, že absence polyglutamylace na podjednotkách tubulinu vede k rychlejší polymerizaci mikrotubulů. Tyto výsledky ukazují, že...
|
|
|
Structural and functional studies of signaling molecules in axon guidance
Knapp, Kryštof ; Rozbeský, Daniel (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
V této práci jsme se zaměřili na studium autoinhibičního mechanismu proteinů z rodiny MI- CAL pomocí biochemických, biofyzikálních a bioinformatických metod. MICAL proteiny patří do skupiny flavinových monooxygenas a sehrávají nezbytnou roli v řadě buněčných pro- cesů zejména skrze regulaci dynamiky cytoskeletonu. MICAL-1 je dlouhodobě studován pro svou roli v mechanismu navádění axonu jako efektor repulzivně signalizačních drah, kde pů- sobí destabilizaci aktinových vláken pomocí své oxidační aktivity. Nedávno zveřejněné studie poukazují na to, že MICAL-1 může působit také jako signalizační molekula skrze lokalizo- vanou produkci peroxidu vodíku, která reguluje funkci dalších proteinů. Navzdory tomu, že je dlouhodobě zřejmé, že aktivita MICAL-1 proteinu musí být přísně regulována, přesný mechanismus této regulace dosud není znám. Na základě studia reakční kinetiky a simu- lací molekulové dynamiky MICAL-1 proteinu z křepelky japonské a jeho zkrácené verze bez C-terminální domény, předkládáme nový model pro autoinhibiční mechanismus MICAL-1 proteinů. Domníváme se, že regulace aktivity MICAL-1 proteinů je zprostředkována skrze interakci mezi C-terminální a monooxygenasovou doménou, která brání plné katalytické ak- tivitě. Dále předkládáme důkazy o tom, že regulace aktivity proteinu není ovlivněna...
|
|
|
Mechanisms of symmetry breaking during embryogenesis
Ždímalová, Michaela ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Búran, Peter (oponent)
Narušenie pravo-ľavej symetrie je dôležitá súčasť správneho vývinu tela mnohých orga- nizmov, vrátane ľudí. Skutočnosť, že pravo-ľavá asymetria je ustanovená vo všetkých jedincoch daného druhu v konzistentnom smere, fascinuje vedcov už dlhý čas. Aj keď niekoľko navrhnutých alebo už všeobecne prijímaných modelov popisuje mechanizmus tohto deja, väčšina z nich buď nepokrýva všetky prípady alebo ich molekulárny mechaniz- mus nie je preskúmaný do hĺbky. Výraznú pozornosť získava v súčasnej literatúre model akto-myozínových tokov, ktoré sú poháňané rotujúcim pohybom vznikajúcim v akto- myozínovom kortexe. Táto práca predstavuje problematiku akto-myozínových tokov, ako aj poskytuje prehľad o predchádzajúcom výskume. Keďže pravo-ľavá asymetria úzko súvisí s chiralitou na rôznych úrovniach, v tejto práci sú tiež diskutované súčasné znalosti o možnom procese prenosu chirality z molekúl na vyššiu úroveň. 1
|
host ::
RSS.