|
|
Studium interakce lektinových receptorů přirozených zabíječů s jejich proteinovými ligandy.
Hernychová, Lucie ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
NK buňky jsou přirozené lymfocyty, které tvoří díky svému receptorovému systému první linii obrany organismu před infekcemi. Jsou důležitou součástí protivirové, ale také protinádorové imunity, hrají roli v transplantační imunitě, autoimunitě nebo reprodukci. Tato diplomová práce se zabývá studiem struktury membránového receptoru NKR-P1B myších NK buněk a jeho interakcí s ligandem Clr-b. Cílem bylo připravit expresní vektor kódující ligand-vazebnou a celou extracelulární část receptoru NKR-P1B a optimalizovat jeho produkci a renaturaci in vitro. Připravené proteiny byly analyzovány gelovou filtrací, elektroforeticky a hmotnostní spektrometrií. Poté byla sledována jejich interakce s proteinem Clr-b biofyzikálními (gelová filtrace a povrchová plazmonová rezonance) a biologickými metodami (značení buněčných preparátů proteiny NKR-P1B s navázanou fluorescenční sondou). In vitro vazebné pokusy nepotvrdily vzájemnou intarakci NKR-P1B a Clr-b, přestože se připravené proteiny vázaly na buňky z kostní dřeně.
|
|
|
Studium vlivu kofaktoru na strukturu proteinu pomocí hmotnostní spektrometrie
Rosůlek, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Bakteriální protein WrbA z E. coli je zakládajícím členem nové rodiny FMN dependentních NAD(P)H oxidoreduktas, tvořící funkční i strukturní vývojový stupeň mezi bakteriálními flavodoxiny a některými savčími NAD(P)H:chinon oxidoreduktasami. Z těchto důvodů je protein WrbA v poslední době intenzivně studován pomocí různých analytických metod i počítačových simulací. Protein WrbA participuje na ochraně buněk před oxidativním stresem, přesná funkce proteinu WrbA in vivo je však stále neznámá. Protein WrbA tvoří v roztocích multimery, v μM koncentracích se při nízkých teplotách (4 řC) nachází ve formě dimeru, s rostoucí teplotou tetramerizuje. Dostupné trojrozměrné krystalové struktury obsahují informace pouze o tetramerní formě proteinu, dimerní forma dosud nebyla strukturně charakterizována. Tato práce byla zaměřena na studium dynamického chování proteinu v roztoku metodami vodík-deuteriové výměny a chemického síťování s následnou analýzou hmotnostním spektrometrem s vysokým rozlišením (FT-ICR). Sledováno bylo chování proteinu v závislosti na vazbě kofaktoru FMN nebo změnách teploty a koncentrace. Analýzou dat z vodík-deuteriové výměny byly získány informace o přístupnosti rozpouštědla a dynamice pro kompletní sekvenci proteinu. Popsán byl stabilizační vliv kofaktoru na tetramerní strukturu proteinu,...
|
|
|
Výzkum Struktury β-N-Acetylhexosaminidasy z Penicillium oxalicum.
Krunclová, Tereza ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
v češtině β-N-Acetylhexosaminidasa (EC 3.2.1.52) je exoglykosidasa, která má ve vláknitých houbách unikátní vlastnosti. Enzym z těchto organismů je dimerní, inducibilní a extraceluárně sekretovaný. Je exprimovaný jako preproprotein, skládá se ze signální sekvence, dlouhého propeptidu a katalytické podjednotky. Ačkoli je enzym široce rozšířen, jeho struktura se v jednotlivých organismech liší. Bakterie mají hexosaminidasy pouze monomerní. Lidské enzymy jsou stejně jako fungální dimerní, ale jen hexosaminidasy z vláknitých hub mají katalytickou podjednotku asociovanou nekovalentně s propeptidem. Propeptid je nezbytnou součástí aktivního enzymu. Existuje homologní model katalytické podjednotky β-N-acetylhexosaminidasy z Penicillium oxalicum, ale struktura propeptidu zatím vyřešená nebyla. Tato diplomová práce se v první části zabývá optimalizací podmínek produkce a purifikace. V druhé části se zabývá strukturními studiemi β-N-acetylhexosaminidasy z vláknité houby Penicillium oxalicum CCF 3438. Tyto studie byly prováděny pomocí metod chemického sítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením. Kombinací těchto metod byla odhalena místa nekovalentní interakce katalytické podjednotky a propeptidu. (In Czech)
|
|
|
Výzkum Struktury β-N-Acetylhexosaminidasy z Aspergillus oryzae
Kukačka, Zdeněk ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
v češtině β-N-acetylhexosaminidasa (EC 3.2.1.52) patří do skupiny exoglykosidas a vyskytuje se prakticky u všech organismů od bakterii po člověka. Plísňová β-N-acetylhexosaminidasa z Aspergillus oryzae se skládá z propeptidu a katalytické podjednotky. Propeptid je na katalytickou podjednotku vázán nekovalentně a je nezbytný pro aktivitu enzymu. Ačkoli struktura katalytické podjednotky byla navržena pomocí homologního modelování, struktura propeptidu ještě doposud odhalena nebyla. V této studii jsme se snažili nalézt oblast, kde se propeptid na katalytickou podjednotku váže. Předkládaná práce se skládá ze dvou částí. První část se zabývá optimalizaci podmínek produkce, purifikace a krystalizace β-N-acetylhexosaminidasy z vláknité houby Aspergillus oryzae. Druhá část je věnována samotnému studiu interakce propeptidu a katalytické podjednotky, která byla charakterizována technikou chemického zesítění. A právě prostřednictvím chemického zesítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením byly odhaleny ne jenom strukturní změny katalytické podjednotky, které jsou závislé na přítomnosti či nepřítomnosti propeptidu, ale i oblasti, kde propeptid interaguje s katalytickou podjednotkou.
|
host ::
RSS.