|
|
Vývoj a optimalizace přípravy řezových preparátů pulců X. tropicalis pro studium migračního a diferenciačního potenciálu testikulárních kmenových buněk
Bláhová, Monika ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Pšenička, Martin (oponent)
Mesenchymální kmenové buňky (MSC) díky svým vlastnostem diferencovat v jiné buněčné typy a migrovat do místa poranění našly široké využití v regenerativní medicíně. Jejich snadná dostupnost spolu se schopností modulovat imunitní systém je předurčuje k léčbě autoimunitních onemocnění nebo obnově poraněných tkání. Stejně jako MSC i Sertoliho buňky (SeC) nacházející se ve varleti mají velmi podobné vlastnosti. V laboratoři školitele byla založena buněčná kultura testikulárních kmenových buněk z varlat juvenilních samců drápatky tropické (Xenopus tropicalis) (XtTSC). Kvůli jejich vizualizaci in vivo byla tato kultura buněk vykazující vlastnosti MSC a SeC transformována plasmidovým vektorem kódujícím červený fluorescenční protein RFP. Cílem této diplomové práce bylo zkoumat chování transformovaných XtTSC v živém organismu. Z tohoto důvodu byly buňky transplantovány do pulců X. tropicalis ve stádiu 41. Následně byl vyhodnocen jejich migrační potenciál. Aby bylo možné studovat také diferenciační potenciál těchto buněk, bylo nezbytné zavést spolehlivou techniku přípravy řezových preparátů. Na základě provedených experimentů se podařilo zjistit, že buněčná kultura XtTSC obsahuje prekurzory SeC a peritubulárních myoidních buněk, avšak in vivo buňky zřejmě přechází do dediferencovaného stavu podobného MSC,...
|
|
|
The study of Xenopus tropicalis testis-derived stem cells
Nguyen, Thi Minh Xuan ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Bartůněk, Petr (oponent) ; Hovořáková, Mária (oponent)
Studium kmenových buněk odvozených z varlat Xenopus tropicalis Nguyen Thi Minh Xuan Abstrakt Sertoliho buňky (SCs) produkují celou řadu molekul klíčových pro determinaci samčího pohlaví a pro regulaci spermatogeneze v dospělosti. Poruchy diferenciace Sertoliho buněk vedou u člověka ke sterilitě. Před nástupem puberty hrají důležitou roli v udržení spermatogoniálních buněk v kmenovém stavu a zajišťují tak jejich dostatečný počet. Zajímavým znakem odlišujícím nezralé a zralé Sertoliho buňky je dočasná přítomnost cytokeratinu, který byl u těchto buněk popsán u celé řady modelových organismů. V rámci této disertační práce jsme se zabývali rozdílnou genovou expresí proteinů spojených s regulací cytokeratinu u nezralých a zralých Sertoliho buněk odvozených z varlat Drápatky tropické (Xenopus tropicalis). Imunohistochemické řezy varlat z juvenilních jedinců a imunocytochemická analýza buněčné kultury odvozené ze stejného zdroje, obsahující nezralé progenitory Sertoliho a peritubulárních myoidních buněk (XtiSC) ukázaly na společnou expresi cytokeratinu a membránového β-kateninu. V případě vzorku z dospělých jedinců nebyla detekována přítomnost ani jednoho z nich. Dále pak podobný fenotyp vykazovaly i migrující Sertoliho buňky (pre- SCs), které se nacházely mimo semenotvorné kanálky. I zde byla exprese obou proteinů...
|
|
|
Vývoj a optimalizace přípravy řezových preparátů pulců X. tropicalis pro studium migračního a diferenciačního potenciálu testikulárních kmenových buněk
Bláhová, Monika ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Soukup, Vladimír (oponent)
Rychlý rozvoj regenerativní medicíny a naléhavá potřeba buněk schopných ovládat imunitní systém nebo dokonce diferencovat do jiných buněčných typů vedla k výzkumu mesenchymálních kmenových buněk. Nápadně podobný charakter mají i Sertoliho buňky, které jsou nezbytné pro správný vývoj spermií ve varleti. V předcházejícím výzkumu byla založena buněčná kultura z varlat juvenilních samců X. tropicalis, která obsahovala buňky s markery mesenchymálních kmenových buněk tak i buněk Sertoliho. Zároveň byly buňky modifikovány a do genomu jim byl zaveden gen pro červený fluorescenční protein (RFP). Cílem této diplomové práce bylo tedy objasnit vlastnosti těchto buněk po jejich mikroinjikování do embryí jedinců stejného druhu (allogenní transplantace). Pro tyto experimenty bylo nutné vyvinout spolehlivou techniku přípravy řezových preparátů, při které by nedocházelo k ztrátě buněk či celých tkání. Metodou vibratomových řezů spolu s imunohistochemickým značením se podařilo zjistit, že buněčná kultura obsahuje buňky prekurzorů Sertoliho a peritubulárních myoidních buněk.
|
|
|
Indukce diferenciace testikulárních kmenových buněk Xenopus tropicalis in vitro.
Strnadová, Karolína ; Tlapáková, Tereza (vedoucí práce) ; Javorková, Eliška (oponent)
Původ somatických buněk vyvíjejících se varlat zůstává u savců prozatím nejasný. Kultura testikulárních buněk založená z varlat juvenilního samce Xenopus tropicalis by mohla přispět k jeho objasnění. Expresní profil ukázal transkripci některých genů pluripotence, dále somatických Sertoliho a peritubulárních myoidních buněk a v neposlední řadě i mezenchymálních kmenových buněk. Naopak exprese genů zárodečných buněk nebyla detekována. Imunocytologická analýza těchto buněk pak odhalila expresi Vimentinu, Sox9 a α-aktinu hladké svaloviny, což naznačuje, že se jedná o společné progenitory Sertoliho a peritubulárních myoidních buněk a že tato buněčná kultura nevznikla spontánní reprogramací spermatogoniálních kmenových buněk. Testování buněčné kultury X. tropicalis během indukce diferenciace in vitro odhalilo, že se pravděpodobně jedná o multipotentní buňky se schopností diferencovat do adipocytů, chondroblastů a osteoblastů. Získání nové populace multipotentních kmenových buněk otevírá nové možnosti v biotechnologiích a medicíně. Klíčová slova: Testikulární somatické buňky, Xenopus tropicalis, progenitor, mezenchymální kmenové buňky, indukce diferenciace, multipotence
|
|
|
Genetické mapování u rodu Xenopus
Seifertová, Eva
Mezi nejvýznamnější modelové organizmy v oblasti vývojové biologie patří bezesporu obojživelník Xenopus tropicalis. Jeho dřívější využití především v embryologickém výzkumu je v současnosti vytlačováno studiemi genetického a genomického charakteru. X. tropicalis má deset párů chromozómů v diploidním genomu a proto je pro tento typ výzkumu velmi vhodný. V posledních deseti letech byl jeho genom osekvenován, několikrát sestaven, vznikla provizorní genetická mapa a byla vytvořena i BAC knihovna mnohonásobně pokrývající genom. Přes veškeré úsilí se u tohoto druhu doposud nepodařilo sestavit kompletní mapu genomu. Ten i nadále zůstává organizován ve formě scaffoldů, které mají často neznámou polohu a i jejich sestavení zůstává i nadále sporné. Náš výzkum byl zaměřen na kompletaci genomu u druhu Xenopus tropicalis a na nové přístupy, které by bylo možné využít i u jiných druhů. Nejprve byla na základě vazebné analýzy a zjištěné fyzické polohy markerů sestavena genetická mapa. Ta nebyla zcela kompletní- nezahrnovala krátké raménko chromozómu 2 a rovněž 15 cM z p raménka chromozómu 7. Protože bylo zaplnění těchto oblastí klasickými metodami velmi obtížné, nebo ještě pravděpodobněji zcela nemožné, byla vynalezena nová metoda pro genetické mapování. Ta zahrnuje mikrodisekci zvolené oblasti, celogenomovou...
|
|
|
Genetické mapování u rodu Xenopus
Seifertová, Eva ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Ráb, Petr (oponent) ; Marec, František (oponent)
Mezi nejvýznamnější modelové organizmy v oblasti vývojové biologie patří bezesporu obojživelník Xenopus tropicalis. Jeho dřívější využití především v embryologickém výzkumu je v současnosti vytlačováno studiemi genetického a genomického charakteru. X. tropicalis má deset párů chromozómů v diploidním genomu a proto je pro tento typ výzkumu velmi vhodný. V posledních deseti letech byl jeho genom osekvenován, několikrát sestaven, vznikla provizorní genetická mapa a byla vytvořena i BAC knihovna mnohonásobně pokrývající genom. Přes veškeré úsilí se u tohoto druhu doposud nepodařilo sestavit kompletní mapu genomu. Ten i nadále zůstává organizován ve formě scaffoldů, které mají často neznámou polohu a i jejich sestavení zůstává i nadále sporné. Náš výzkum byl zaměřen na kompletaci genomu u druhu Xenopus tropicalis a na nové přístupy, které by bylo možné využít i u jiných druhů. Nejprve byla na základě vazebné analýzy a zjištěné fyzické polohy markerů sestavena genetická mapa. Ta nebyla zcela kompletní- nezahrnovala krátké raménko chromozómu 2 a rovněž 15 cM z p raménka chromozómu 7. Protože bylo zaplnění těchto oblastí klasickými metodami velmi obtížné, nebo ještě pravděpodobněji zcela nemožné, byla vynalezena nová metoda pro genetické mapování. Ta zahrnuje mikrodisekci zvolené oblasti, celogenomovou...
|
|
|
Příprava transgenní kultury testikulárních kmenových buněk Xenopus tropicalis.
Vegrichtová, Markéta ; Tlapáková, Tereza (vedoucí práce) ; Drobná Krejčí, Eliška (oponent)
Testikulární kmenové buňky (TSCs) představují relativně dostupný zdroj potencionálně pluripotentních buněk, které jsou významné zejména pro své uplatnění v regenerativní medicíně. Pro studium migračního a diferenciačního potenciálu kmenových buněk je vhodným modelovým organismem Xenopus tropicalis. Tento obojživelník se vyznačuje vnějším oplozením a embryonálním vývojem značného množství zárodků v rámci jedné snůšky. Oocyty a embrya jsou dostatečně velká (kolem 1 mm) a tím i vhodná pro mikromanipulační zásahy. Laboratoř vývojové biologie PřF UK uspěla v založení smíšené buněčné kultury TSCs rostoucích na podkladové vrstvě pre-Sertoliho buněk. Tato kultura byla odvozena z varlat juvenilního samce X. tropicalis. V rámci studia jejich diferenciačního potenciálu bylo zjištěno, že rozhodujícím faktorem umožňujícím rychlou proliferaci kmenových buněk a jejich formování do charakteristických kolonií je leukemický inhibiční faktor (LIF). Tento protein je produkován oběma typy buněk přítomných v kultuře. Stejný pozitivní vliv na proliferační potenciál kmenových buněk má i myší LIF, což ukazuje na evoluční konzervovanost metabolických drah souvisejících s udržením kmenového charakteru. RT-PCR analýza dále odhalila téměř identický expresní profil u TSCs a podkladových pre-Sertoliho buněk. Na základě těchto...
|
|
|
Studium migračního potenciálu testikulárních kmenových buněk u Xenopus tropicalis
Fuxová, Helena ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Černý, Robert (oponent)
Problematika kmenových buněk díky svému možnému terapeutickému potenciálu představuje jednu z nejperspektivnějších oblastí oblastí biologie. Náplní této diplomové práce bylo studium migračního potenciálu testikulárních kmenových buněk Xenopus tropicalis, jejichž kultura byla založena z varlat juvenilních samců v laboratoři školitele. Díky vnějšímu oplození a embryonálnímu vývoji představuje Xenopus ideální modelový organismus pro transplantační a mikroinjekční experimenty in-vivo. Transplantance vitálně (PKH26) označených testikulárních kmenových buněk do blastul a periteonea pulců prokázala jejich široký migrační potenciál čítající střevo (entoderm), srdce, pronefros, genitální rýhu (mezoderm), epidermis a nervová soustava (ektoderm). Na základě mých experimentů jsem zjistila, že ideální množství transplantovaných buněk se pohybuje v rozmezí mezi 250-500 na jednoho pulce. Pro účely další charakterizace těchto kmenových buněk jsem zkonstruovala plazmidový vektor nesoucí gen pro červený fluorescenční protein. Tento plazmid byl posléze použit k přípravě žab celotělně exprimujících Katushka RFP pod kontrolou CAG promotoru. Po křížení transgenních jedinců s divokým typem bude v rámci jejich potomstva možné použít RFP pozitivní samce k založení kultury testikulárních kmenových buněk stabilně exprimujících...
|
|
|
Příprava rekombinantních růstových faktorů X. tropicalis a jejich charakterizace v testikulární tkáňové kultuře
Borecká, Marianna ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Drobná Krejčí, Eliška (oponent)
V Laboratoři vývojové biologie se podařilo založit dlouhodobou kulturu z varlat druhu Xenopus tropicalis. Obsahuje převážně pre-Sertoliho buňky, jejichž podpůrná vyživovací vrstva umožňuje kultivaci kmenových buněk, pravděpodobně sprematogoniálních. Tato diplomová práce si kladla za cíl připravit dva růstové faktory, FGF2 (fibroblast growth factor 2) a GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), a charakterizovat jejich vliv na zmíněnou kulturu během její kultivace. Faktory byly vybrány na základě teorie o mikroenvironmentální nice, podle které se FGF2 a GDNF jeví jako nejdůležitější pro proliferaci a sebe-obnovu spermatogoniálních kmenových buněk. V rámci diplomové práce se podařilo pomocí expresního plazmidu pET-15b získat rekombinantní FGF2. Jeho charakterizace v testikulární kultuře přinesla velmi překvapivé výsledky. Pre-Sertoliho buňky v jeho přítomnosti během týdenní kultivace odumíraly. Podobný výsledek byl zatím popsán pouze u kultury diferencujících osteoblastů. Další experimenty budou muset prokázat, zda se jedná o apoptózu a proč testikulární buňky reagují tímto způsobem. Klíčová slova: Xenopus tropicalis, FGF2, GDNF, SSC, pre-Seroliho buňky
|
|
|
Fyzické mapování vazebně neidentifikovaných oblastí pomocí BAC klonů u Xenopus tropicalis
Špirhanzlová, Petra ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Marec, František (oponent)
Xenopus leavis, který byl ve 20.století oblíbeným modelovým organismem je v současné době nahrazován diploidním druhem Xenopus tropicalis, který má nejenkratší generační dobu, ale i menší genom. Jedním z nedostatků Xenopus tropicalis je absence úplné vazebné a fyzické mapy. Podle JGI genomové databáze (assembly 4.1) se nachází na krátkém raménku chromozómu 2 a 7 nemapované oblasti, do kterých byly v novější verzi (assembly 7.1) přiřazena řada BAC klonů s osekvenovaným jedním nebo oběma konci. Vyvstává ovšem otázka, zda tyto 100 bp dlouhé sekvence stačí k unikátnímu zařazení BAC klonu do genomu Xenopus tropicalis. S cílem ověření správnosti zařazení těchto BAC klonů v JGI databázi byly vybrány BAC klony, které se podle databáze nachází na krátkém raménku chromozómu 2. Pomocí fluorescenční in situ hybridizace byly tyto BAC klony lokalizovány na metafázních chromozómech. Vybrané BAC klony vykazovaly signál na krátkém raménku chromozómu 1, místo na krátkém raménku chromozómu 2 a ve většině případech byly opačně orientované, což ukazuje na to, že koncová sekvence 100 pb je pravděpodobně nedostatečná k unikátní identifikaci BAC klonu do chromozómu.V rámci této práce byl zaveden funkční protokol pro izolaci a značení BAC DNA
|
host ::
RSS.