|
|
Analýza plicních vzorků infikovaných Aspergillus fumigatus a Pseudomonas aeruginosa metodami rastrovací elektronové mikroskopie
Juříková, Tereza ; Benada, Oldřich (vedoucí práce) ; Nebesářová, Jana (oponent)
Infekční onemocnění představují i přes významný pokrok v medicíně ohrožení života, k čemuž přispívá nárůst multirezistentních kmenů mikroorganismů či pozdní odhalení původce onemocnění. Oportunně patogenní houba Aspergillus fumigatus vyvolává onemocnění dýchací soustavy, která nazýváme aspergilózy. Invazivní plicní aspergilóza se rozvíjí u imunokompromitovaných pacientů po vdechnutí všudypřítomných spor A. fumigatus a ročně na ni umírá 450 000 pacientů. V infikované tkáni se tvoří biofilm, který částečně chrání A. fumigatus před antimikrobiálními látkami. Pozdě zahájená terapie proto nemusí být dostatečně účinná. Infekce imunokompromitovaných pacientů a tvorba biofilmů je charakteristická i pro gram negativní bakterii Pseudomonas aeruginosa, která je díky produkci mnoha virulenčních faktorů a multirezistenci k antibiotikům obávaným oportunním patogenem. Rastrovací elektronová mikroskopie (SEM) poskytuje detailní informace o morfologii mikroorganismů s rozlišením desítek nanometrů, což umožňuje pozorovat mikroorganismy v infikované tkáni i její patologické změny. Hmotnostní spektrometrie umožňuje sledovat přítomnost a průběh infekce na základě detekce charakteristických molekul produkovaných mikroorganismy. Cílem této práce bylo optimalizovat přípravu vzorků plicní tkáně infikované A. fumigatus nebo...
|
|
|
Izolace bakteriálního flagelinu jako imunogenu pro přípravu protilátek pro pacienty s cystickou fibrosou
Supová, Veronika ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Cystická fibróza (CF) je autozomálně recesivní onemocnění způsobeno mutacemi v CFTR genu. Důsledkem této mutace je špatná funkce chloridového kanálku tvořeného CFTR proteinem. Díky této abnormalitě se sníží či ztratí funkce transportu chloridových iontů a tím dojde k utvoření hlenu nazývaného mukus. Mukus se nejčastěji utváří v plicích a je ideálním prostředím pro patogenní bakterie, jako například Pseudomonas aeruginosa (PA). Pseudomonas aeruginosa je aerobní, gramnegativní, podmíněný patogen, vyskytující se u pacientů se sníženou imunitou či právě u pacientů s CF, kteří jsou často hospitalizováni v nemocnici. Obsahuje jeden polární bičík, jehož vlákno je mimo jiné složeno z proteinu flagelinu. Právě bičík je jedním z nejdůležitějších virulentních faktorů bakterie PA. Tato práce je zaměřena na izolaci flagelinu z bičíku bakterie PA, který poslouží jako antigen pro přípravu profylaktických protilátek pro pacienty s CF. Flagelin byl izolován pomocí čtyř metod založených na různých kombinacích centrifugačních a precipitačních kroků. Tyto publikované metody bylo třeba optimalizovat tak, aby se podařilo izolovat flagelin. Finální preparáty a meziprodukty byly analyzovány SDS-elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a přítomnost flagelinu byla ověřována hmotnostní spektrometrií. Z výsledku vyplývá, že...
|
|
|
Využití slepičích protilátek proti lektinu PAIIL pro prevenci infekcí Pseudomonas aeruginosa u pacientů s cystickou fibrosou
Kubíčková, Božena ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Anzenbacherová, Eva (oponent) ; Eckschlager, Tomáš (oponent)
Cystická fibróza (CF) je jedním z poměrně běžných dědičných onemocnění, způsobené mutací genu kódujícího protein CFTR, který tvoří chloridový kanál, jež významně ovlivňuje homeostázi iontů a s ní spojené hospodaření buňky s tekutinami. Toto onemocnění postihuje zejména dýchací a trávicí soustavu, avšak z hlediska ohrožení života je nejzávažnější postižení respiračního traktu. Pacienti s CF trpí častými a opakovanými infekcemi dýchacích cest, které vedou k rozvoji chronického zánětu a postupné destrukci plicní tkáně. Tyto infekce plic vyvolané většinou oportunním patogenem Pseudomonas aeruginosa, který je specifický pro pacienty s CF, jsou nejčastější příčinou morbidity a mortality těchto nemocných. V současnosti jsou v terapii infekcí Pseudomonas aeruginosa používána antibiotika, avšak vzhledem ke vzniku rezistencí jsou hledány nové způsoby antibakteriální terapie. Vedle aktivní imunizace pacientů s CF proti Pseudomonas aeruginosa nabízí slibné možnosti pasivní imunizace pacientů pomocí specifických slepičích protilátek cílených proti tomuto patogenu. Cílem předkládané disertační práce bylo proto ověřit profylaktický potenciál slepičích protilátek IgY proti virulenčnímu faktoru Pseudomonas aeruginosa - lektinu PAIIL a dále vyvinout experimentální zvířecí model napodobující podmínky v respiračním...
|
|
|
Interakce bakteriálních lektinů s epitelem lidských plic
Vyhnalová, Kateřina ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Recesivní autozomální onemocnění cystická fibróza (CF) je způsobena mutací v genu CFTR ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator"), který kóduje stejnojmenný chloridový kanál. Tato mutace vede k nesprávnému transportu iontů, což má za následek tvorbu nadměrně viskózního hlenu na povrchu dýchacích cest, a následně ke zvýšené náchylnosti k bakteriálním onemocněním. Právě infekce dýchacího systému jsou nejčastější příčinou úmrtí pacientů s CF. Jedním z nejnebezpečnějších patogenů pro tyto pacienty je Pseudomonas aeruginosa (PA), bakterie, která ke své patogenitě využívá řadu faktorů virulence, jako jsou pili nebo adheziny. Lektin PA-IIL, ze skupiny adhezinů PA, se vyznačuje vysokou afinitou k L-fukose, takže přispívá k adherenci PA na málo sialylovaný epitel pacientů s CF. V této práci byly zkoumány interakce mezi PA-IIL a plicním epitelem. Byly využity buněčné linie CuFi-1 (pacient s CF) a NuLi-1 (zdravý jedinec), které byly zkoumány ex vivo. Část těchto linií byla vystavena působení neuraminidasy. Lektin PA-IIL byl izolován z buněčné linie E. coli pET25_PAIIL a následně fluorescenčně značen DyLight 488. Aktivita zmíněného lektinu byla ověřena pomocí aglutinace červených krvinek. Postup značení nezměnil vazebnou afinitu lektin-sacharid. Interakce mezi lektinem a buněčnými liniemi byly...
|
|
|
Mechanismus interakce bakteriálních toxinů zvyšujících vnitrobuněčné cAMP s hostitelskou buňkou
Lepesheva, Anna ; Mašín, Jiří (vedoucí práce) ; Petráčková, Denisa (oponent)
Cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) je univerzálním druhým poslem, který reguluje velké množství molekulárních mechanismů uvnitř buňky. Hladina syntetizovaného cAMP je přísně regulována vnitrobuněčnou adenylátcyklázou (AC), a proto tento enzym často představuje cíl pro různé bakteriální toxiny. Pro manipulaci s hladinou vnitrobuněčného cAMP v cílové buňce vyvinuly bakterie pro své toxiny dvě odlišné strategie. Adenylátcyklázový toxin (CyaA) bakterie Bordetella pertussis, edemogenní faktor (EF) bakterie Bacillus anthracis a ExotoxinY bakterie Pseudomonas aeruginosa mají ve své struktuře enzymatickou AC doménu, která má po aktivaci intracelulárním kofaktorem několikrát vyšší aktivitu než vlastní eukaryotní adenylátcykláza, nacházející se uvnitř hostitelské buňky. Jiné toxiny, jako pertusový toxin (PT) bakterie Bordetella pertussis, cholerový toxin (CT) bakterie Vibrio cholerae a tepelně labilní toxin bakterie Escherichia coli využívají ADP-ribosylaci heterotrimerních G proteinů spřažených s vnitrobuněčnou AC pro zvýšení její aktivity a následnou nekontrolovanou produkci cAMP. Tato práce představuje literární rešerši uvedených toxinů s důrazem na jejich molekulární mechanizmy interakce s hostitelskou buňkou. Klíčová slova: pathogenní bakterie, faktory virulence, vnitrobuněčná hladina cAMP, bakteriální...
|
|
|
Vývoj antibakteriálních protilátek pro pacienty s cystickou fibrosou
Vašková, Michaela ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Autozomálně recesivní onemocnění cystická fibrosa (CF) způsobené mutacemi genu CFTR ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator") vede k absenci či defektům CFTR proteinu s funkcí chloridového kanálu. Pro toto onemocnění je typická zejména náchylnost k bakteriálním infekcím dýchacího ústrojí z důvodu hromadění zahuštěného hlenu a pozměněné glykosylace v plicích. Tyto infekce nejčastěji způsobuje bakterie Pseudomonas aeruginosa (PA), k jejíž patogenitě přispívá i lektin PA-IIL. Tento lektin má vysokou afinitu k L-fukose a patří mezi adhesiny PA. Tato práce je zaměřena na studium vlivu anti-PA-IIL protilátek izolovaných z vaječných žloutků a multivalentních inhibitorů PA-IIL na bázi fukosy na adherenci PA k buňkám plicního epitelu. Protilátky byly izolovány z vaječných žloutků slepice před a po imunizaci lektinem PA-IIL. Specifické anti-PA-IIL protilátky byly získány afinitní chromatografií na koloně s imobilizovaným PA-IIL. Metodou ELISA byla ověřena schopnost těchto protilátek rozpoznat PA-IIL. Přítomnost PA-IIL v bakteriální kultuře Pseudomonas aeruginosa (PAK, ST 1763) a schopnost protilátek rozpoznat tento bakteriální lektin byla ověřena pomocí metody Western blot s následnou imunodetekcí. Byly též zjištěny vhodné podmínky kultivace pro expresi tohoto lektinu. Vliv protilátek na adhezi...
|
|
|
Analýza plicních vzorků infikovaných Aspergillus fumigatus a Pseudomonas aeruginosa metodami rastrovací elektronové mikroskopie
Juříková, Tereza ; Benada, Oldřich (vedoucí práce) ; Nebesářová, Jana (oponent)
Infekční onemocnění představují i přes významný pokrok v medicíně ohrožení života, k čemuž přispívá nárůst multirezistentních kmenů mikroorganismů či pozdní odhalení původce onemocnění. Oportunně patogenní houba Aspergillus fumigatus vyvolává onemocnění dýchací soustavy, která nazýváme aspergilózy. Invazivní plicní aspergilóza se rozvíjí u imunokompromitovaných pacientů po vdechnutí všudypřítomných spor A. fumigatus a ročně na ni umírá 450 000 pacientů. V infikované tkáni se tvoří biofilm, který částečně chrání A. fumigatus před antimikrobiálními látkami. Pozdě zahájená terapie proto nemusí být dostatečně účinná. Infekce imunokompromitovaných pacientů a tvorba biofilmů je charakteristická i pro gram negativní bakterii Pseudomonas aeruginosa, která je díky produkci mnoha virulenčních faktorů a multirezistenci k antibiotikům obávaným oportunním patogenem. Rastrovací elektronová mikroskopie (SEM) poskytuje detailní informace o morfologii mikroorganismů s rozlišením desítek nanometrů, což umožňuje pozorovat mikroorganismy v infikované tkáni i její patologické změny. Hmotnostní spektrometrie umožňuje sledovat přítomnost a průběh infekce na základě detekce charakteristických molekul produkovaných mikroorganismy. Cílem této práce bylo optimalizovat přípravu vzorků plicní tkáně infikované A. fumigatus nebo...
|
|
|
Protilátky proti lektinu PA-IIL jako prostředek prevence bakteriálních infekcí u pacientů s cystickou fibrosou
Vašková, Michaela ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Cystická fibrosa je autozomálně recesivní onemocnění způsobené mutací genu CFTR, která vede k poškození stejnojmenného proteinu s funkcí iontového kanálu. V důsledku poškození dochází k narušení rovnováhy elektrolytů. Nejvíce je postiženo dýchací ústrojí, kde dochází k zahuštění hlenu a ke změnám v glykosylaci povrchových struktur buněk plicního epitelu. Výše uvedené změny vedou k nedostatečné obranné funkci plic a větší náchylnosti k bakteriálním infekcím. Nejčastějším patogenem dýchacích cest pacientů s CF je Pseudomonas aeruginosa. Tato bakterie obsahuje řadu virulentních faktorů a má schopnost tvořit biofilm, který ji chrání před obrannými mechanismy hostitele a účinky antibiotik. Léčba antibiotiky je navíc komplikovaná vznikem rezistencí. Slepičí protilátky vykazují značný potenciál jako prostředek prevence bakteriálních infekcí plic u pacientů s CF. Efekt specifických a nespecifických protilátek na adherenci kontrolního kmenu Pseudomonas aeruginosa (PAK, ST 1763) ex vivo byl sledován na modelovém systému buněčných linií plicních epiteliálních buněk od pacienta s CF (CuFi-1) a zdravého jedince (NuLi-1). Bakteriální a plicní buňky byly značeny fluorescenčními barvivy PKH, vyhodnocení bylo prováděno spektrofluorimetricky. Bylo ověřeno, že slepičí protilátky proti PA-IIL mají schopnost specificky...
|
|
|
Studium adherence bakterií na plicní epitel nemocných Cystickou fibrosou
Vašková, Lucie ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Cystická fibróza je autozomálně recesivní onemocnění, které patří k nejčastějším dědičným poruchám. Tato nemoc je způsobena mutací v genu CFTR kódujícím chloridový kanál, čímž dochází k poruše transportu iontů a výraznému zvýšení viskozity hlenů. Nejvíce postižen je respirační systém. Zvýšení obsahu solí a přítomnost hustého hlenu v plicích potlačují antibakteriální účinky imunitního systému. Bakteriální infekce jsou nejčastější příčinou smrti pacientů s CF, zejména infekce Pseudomonas aeruginosa. Nejčastěji je pro terapii infekce tímto patogenem používána léčba antibiotiky, která je komplikována častým vznikem rezistencí. Jsou proto hledány nové možnosti terapie. Nadějnou by mohla být pasivní imunizace pacientů pomocí žloutkových protilátek IgY. Pro sledování vlivu těchto protilátek in vivo byl zvolen modelový systém buněk plicního epitelu zdravého pacienta (NuLi-1), pacienta trpícího CF (CuFi-1) a 3 kmenů bakterií Pseudomonas aeruginosa. Byly porovnávány protilátky proti lektinu Pseudomonas aeruginosa PA-IIL, který je významnou adhezivní strukturou této bakterie, pocházející od 2 různých imunizovaných zvířat. K vizualizaci a vyhodnocení adheze bakterií na plicní buňky v přítomnosti protilátek bylo používáno barvení fluorescenčními sloučeninami PKH a následné spektrofluorimetrické vyhodnocení....
|
|
|
Slepičí protilátky jako prostředek pasivní imunizaci nemocných cystickou fibrosou
Hadrabová, Jana ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Cystická fibróza (CF) je vrozené onemocnění zejména dýchacích cest a zažívacího ústrojí. Přenos je autozomálně recesivní, nemoc spočívá v mutaci genu pro protein CFTR, který funguje jako iontový kanál pro přenos chloridových aniontů. Důsledkem omezení jeho funkce je výrazné zahuštění plicního sekretu, ve kterém se pak snadněji zachytávají a rostou specifické mikroorganismy, zejména Pseudomonas aeruginosa. Infekce je nejprve léčena pomocí antibiotik, bakterie se však vůči nim brzy stávají rezistentní. Vzniká chronický zánět, jehož následkem je jizvení plicní tkáně (fibrosa). Zejména kvůli rezistencím vůči antibiotikům jsou hledány nové metody léčby pacientů s CF. Takovou metodou by mohla být pasivní imunizace pomocí slepičích protilátek IgY, které jsou specifické proti virulenčním faktorům Pseudomonas aeruginosa a jsou schopny je neutralizovat. Tyto protilátky je možné z roztoku pomocí nebulizátoru přeměnit na aerosol, který by mohli pacienti vdechovat. Protože by, vzhledem ke své struktuře, samy mohly potenciálně způsobovat zánětlivé reakce, bylo potřeba vyzkoušet inhalaci zdravými jedinci. K tomu bylo využito potkanů Wistar, jako experimentálního modelu. Nejprve byly protilátky izolovány, pak byl enzymaticky odštěpen fragment Fab a byla provedena purifikace. V inhalačním experimentu byl použit...
|
host ::
RSS.