|
|
Molekulární mechanismus regulace funkce kaspasy-2 pomocí proteinů 14-3-3
Kalábová, Dana ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent) ; Žáková, Lenka (oponent)
Molekulární mechanismus regulace funkce kaspasy-2 pomocí proteinů 14-3-3 Abstrakt Kaspasa-2 je proteasa stojící apikálně v kaskádě dějů vedoucích k apoptose. Správně vedený proces apoptosy likviduje poškozené buňky, autoreaktivní lymfocyty či nadbytečné skupiny buněk v ontogenezi. Proces aktivace kaspasy-2 musí být přesně regulovaný. Jedním z popsaných způsobů regulace kaspasy-2 způsobující její inhibici je posttranslační modifikace fosforylace spojená s následnou vazbou regulačního skafoldového proteinu 14-3-3. Cílem disertační práce je vysvětlit molekulární mechanismus této regulace. Pro porozumění interakce mezi proteiny bylo nezbytné nejprve určit fosforylační místa v molekule kaspasy-2 rozpoznávaná proteinem 14-3-3 a poté popsat detailní strukturu vazebného komplexu. Struktura byla popsána řadou biochemických a biofyzikálních metod, jako je analytická centrifugace, nativní elektroforesa v TBE pufru, polarizačně fluorescenční esej, vodík/deuteriová výměna spojená s hmotnostní spektrometrií či krystalizace, a výsledky vedly k podnětným závěrům. Aktivace kaspasy-2 začíná její vazbou na adaptorové proteiny, štěpením a dimerizací katalytických podjednotek. Z výsledků vyplynulo, že protein 14-3-3 může svou vazbou inhibovat aktivaci kaspasy-2 skrze blokování sekvencí nezbytných pro dimerizaci a/nebo vazbu...
|
|
|
Regulace transkripce u Streptococcus pneumoniae
Zajíčková, Adéla ; Doubravová, Linda (vedoucí práce) ; Hnilicová, Jarmila (oponent)
Regulace transkripce u Streptococcus pneumoniae Lidský oportunní patogen Streptococcus pneumoniae kóduje jedinou Ser/Thr proteinkinázu eukaryotického typu - StkP, která hraje důležitou roli při buněčném růstu a dělení. Ve fosfoproteomové studii bylo zjištěno, že StkP v reakci na antibiotický stres fosforyluje in vivo SigA. Jedná se o housekeeping sigma faktor, který je společně s RNA polymerázou zodpovědný za transkripci většiny genů S. pneumoniae. Fosforylace tohoto klíčového regulátoru by mohla hrát významnou roli v regulaci transkripce. Touto prací jsme potvrdili, že kináza StkP fosforyluje SigA in vitro na pozicích T291 a T306. Fosforylace SigA in vivo se nepodařilo detekovat. Úlohu fosforylace proteinu se zatím nepodařilo objasnit. U RNAP S. pneumoniae jsme analýzou za pomoci hmotnostní spektrometrie detekovali všechny podjednotky RNAP, včetně SigA. V RNAP komplexu byl identifikován protein Spr0726, u kterého jsme imunoprecipitací potvrdili reciprokou interakci s RNAP. V rámci ověření funkce tohoto proteinu jsme zjistili, že odstranění genu spr0726 způsobuje snížení množství a 'podjednotky RNAP v buňce. Tyto výsledky naznačují, že by Spr0726 mohl hrát roli při stabilizaci podjednotek RNAP komplexu. V poslední části práce jsme s využitím fluorescenční mikroskopie pozorovali lokalizaci kinázy StkP v...
|
|
|
The impact of post-translational modifications on TRPC5 ion channel activation and modulation
Mitro, Michal ; Zímová, Lucie (vedoucí práce) ; Dolejší, Eva (oponent)
Transientní receptorový potenciálový kanonický kanál 5 (TRPC5), propustný pro vápenaté ionty, se uplatňuje jako receptor v senzorických neuronech, ledvinách a mozku, kde ovlivňuje zánětlivé procesy a různé typy bolesti. Přestože se předpokládá, že posttranslační modifikace významně ovlivňují vrátkování TRPC5 a jeho transport na membránu, bylo těchto procesů dosud popsáno poměrně málo. Za využití dostupných bioinformatických databází a dat z hmotnostní spektrometrie byla identifikována v rámci předložené práce fosforylační místa. Následně byla provedena funkční charakterizace těchto míst zavedením aspartátových (napodobujících fosfát) nebo alaninových (neumožňujících vazbu fosfátu) mutací pomocí cílené mutageneze. Technikou terčíkového zámku v uspořádání snímání aktivity z celé buňky byly zkoumány membránové proudy vyvolané napětím nebo působením agonisty. Výsledky ukázaly, že individuální záměny S193 a S195 z N-koncové domény za aspartáty významně zpomalují kinetiku vrátkování. Kromě toho byl u S193A pozorován fenotyp zesílení funkce kanálu. Molekulárně dynamické simulace naznačily, že fosforylace S193 způsobuje změny v interakcích mezi sousedními podjednotkami. Biotinylace navíc potvrdila, že změny aktivity mutací S193 nejsou způsobeny zvýšeným transportem proteinu na plazmatickou membránu....
|
|
|
Functional analysis of the ERK signaling pathway in epithelial cells
Galvánková, Kristína ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Rösel, Daniel (oponent)
Signální dráha MAPK/ERK, která je v rámci eukaryot evolučně konzervovaná, je jednou z nejintenzivněji studovaných signálních drah a skládá se z třístupňové kaskády proteinkináz Raf-MEK-ERK. Široká škála extracelulárních signálů je prostřednictvím sekvenčních fosforylací jednotlivých členů této dráhy přenášena od receptorů k stovkám substrátů. Díky přesné časové a prostorové regulaci jednotlivých fosforylačních událostí je docíleno specifické odpovědi buňky, která vede ke správnému průběhu fyziologických procesů včetně genové exprese, proliferace, diferenciace, migrace a apoptózy. Narušení regulačních mechanismů této dráhy může vést k patologické signalizaci, například k nádorové transformaci. Specifická regulace signalizace je mimo jiné zajištěna existencí více izoforem na každé úrovni signální dráhy ERK. Funkční rozdíly mezi efektorovými proteinkinázami ERK1 a ERK2 jsou již dlouho diskutovanou problematikou, nicméně stále není jasné, jaký význam mají v dosažení správné buněčné odpovědi. V této práci jsme se zaměřili na funkční charakterizaci izoforem ERK1 a ERK2 v epiteliálních buňkách MDCK. Konkrétně jsme sledovali vliv inaktivace izoformy ERK2 na morfologii a expresi vybraných substrátů. Zjistili jsme, že inaktivace izoformy ERK2 vede k poruchám formování epitelu, jelikož buňky ztrácejí svůj...
|
|
|
Role of the WIP1 phosphatase in the nucleolus
Palková, Natálie ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Sztacho, Martin (oponent)
Protein fosfatáza 2C delta (známá jako WIP1) je důležitým negativním regulátorem signalizace odpovědi buňky na poškození DNA (DDR). Jako protein vázaný na chromatin defosforyluje, a tedy inaktivuje ATM kinázu a transkripční faktor p53. Zvýšená exprese WIP1 potlačuje funkci tumour supresoru p53 a přispívá k rozvoji řady nádorových onemocnění včetně nádorů prsu a mozku. V posledních letech bylo ukázáno, že WIP1 může regulovat rovněž buněčné procesy, které nejsou přímo spojeny s DDR, jako je například zajištění stability telomer. Alternativní funkce proteinu WIP1 však nebyly dosud plně pochopeny. V této práci jsme popsali novou roli proteinu WIP1 v jadérku, organele zodpovědné za produkci ribozomů. Zjistili jsme, že WIP1 asociuje s mnoha jadérkovými proteiny, a pomocí delečních mutant jsme identifikovali jadérkovou lokalizační sekvenci (NoLS) na C-konci proteinu. Pomocí super-rezoluční mikroskopie jsme identifikovali lokalizaci WIP1 fosfatázy ve fibrilárních centrech jadérka . Za použití inducibilního Cas9 systému pro generování dvouřetězcových zlomů v rDNA jsme dále zjistili, že WIP1 ovlivňuje akumulaci faktorů zajišťujících opravu poškození DNA. Analýza založená na kvantitativní mikroskopii ukázala, že aktivita WIP1 má vliv také morfologii jadérka. Na základě našich výsledků usuzujeme, že WIP1...
|
|
|
Hypotetický protein Spr1962 jako nový substrát signalizační dráhy Ser/Thr proteinkinázy StkP a fosfatázy PhpP.
Mašková, Kateřina ; Ulrych, Aleš (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Hypotetický protein Spr1962 jako nový substrát signalizační dráhy Ser/Thr proteinkinázy StkP a fosfatázy PhpP Extracelulární lidský patogen Streptococcus pneumoniae kóduje ve svém genomu pouze jednu serin/threoninovou proteinkinázu eukaryotního typu (StkP) a příslušnou PP2C fosfatázu (PhpP), proto je unikátním modelovým organismem pro studium signalizačních drah u bakterií. Dosud bylo identifikováno a charakterizováno několik substrátů těchto signalizačních proteinů, mezi které patří například proteiny DivIVA, KhpB, FtsA, FtsZ, MacP, GlmM, GpsB, ComE a další. Jedná se o proteiny, které se účasní různých buněčných procesů, včetně buněčného dělení a syntézy peptidoglykanu. Pomocí globální fosfoproteomové studie založené na LC-MS analýze bylo zjištěno, že jedním z identifikovaných proteinů je hypotetický protein Spr1962, jehož fosforylace byla detekována pouze v hyperfosforylovaném kmeni s odstraněnou fosfatázou PhpP. Cílem této práce byla charakterizace nového substrátu Spr1962 a objasnění jeho možné funkce. Vzhledem k významné strukturní podobnosti s flotilinovým proteinem bakterie Bacillus subtilis FloT bylo navrženo, že by se mohlo jednat o protein s analogickou funkcí u pneumokoka. Bylo zjištěno, že odstranění tohoto genu způsobuje fenotyp zvětšených buněk na různých genetických pozadích. Sledováním...
|
|
|
Trk1 Potassium Importers - key transport systems for yeast cell fitness and stress tolerance
Masaryk, Jakub ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Malínský, Jan (oponent)
Jedním z klíčových předpokladů pro dělení kvasinkových buněk je příjem základních živin a iontů, jako je draslík. Draslík je důležitý, monovalentní kation a jeho dostatečná intracelulární koncentrace je rozhodující pro různé procesy, například regulaci membránového potenciálu a buněčného turgoru, enzymatickou aktivitu a syntézu proteinů. Dostatečná vnitřní koncentrace draslíku je také jedním z klíčových signálů pro buněčné dělení. Nicméně protože také přebytek draslíku může vést k nepříznivým fyziologickým důsledkům v kvasinkách, jako jsou deacidifikace vakuol a depolarizace plazmatické membrány, je pro kvasinkové buňky nezbytné, aby celý proces získávání draslíku byl přísně regulován, aby se udržela jeho správná homeostáze. V kvasinkách Saccharomyces cerevisiae je za klíčového hráče v příjmu draslíku považován uniportér Trk1. Cílem předkládané disertační práce bylo získat nové poznatky týkající se proteinu Trk1, konkrétněji studovat jeho schopnost modifikovat vlastní kapacitu pro příjem draslíku, regulaci pomocí fosforylace a také zapojení do přežití buněčné smrti vyvolané glukózou (GICD). Dále byly také charakterizovány systémy příjmu draslíku u vybraných nekonvenčních, kvasinkových druhů. Nejvýraznějším rysem Trk1 je jeho schopnost přepínat mezi dvěma afinitními stavy, nízko- a vysoce-afinitní...
|
|
|
Vliv proteinu 14-3-3 na intradoménové interakce ubiktivin ligasy Nedd4-2
Pohl, Pavel ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Žáková, Lenka (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
CZ Lidská ubikvitin ligasa Nedd4-2 (NEDD4L) ubikvitinuje široké spektrum membránových proteinů a receptorů a hraje tak klíčovou roli v udržování homeostázy organismu. Tento enzym je regulován fosforylací a následnou interakcí s proteiny 14-3-3, čímž je primárně ovlivněna schopnost proteinu Nedd4-2 interagovat s různými substráty. Jen velmi málo je však známo o molekulární podstatě této protein-proteinové interakce. V této práci jsme se zaměřili na biofyzikální charakterizaci úlohy jednotlivých fosforylačních míst a mapování strukturních změn Nedd4-2 způsobených vazbou proteinů 14-3-3. Naše experimenty za užití metod analytické ultracentrifugace odhalily, že k stabilní vazbě proteinu Nedd4-2 na proteiny 14-3-3 je zapotřebí primárně dvou fosforylačních míst Ser342 a Ser448 . Krystalová struktura komplexu 14-3-3ηΔC:Nedd4-2335-455 T367A poté odhalila simultánní vazbu obou fosforylovaných reziduí do vazebného žlábku proteinu 14-3-3. Modelování na základě dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění spojeného s hmotnostní spektrometrií nastínilo rozsáhlé strukturní změny v oblasti jednotlivých domén proteinu Nedd4-2. Vazba proteinu 14-3-3η blokuje doménu WW3 proteinu Nedd4-2 v centrálním kanálu proteinu 14-3-3 a zároveň mění vzájemné pozice domén WW2 a WW4. WW domény Nedd4-2 jsou...
|
|
|
Vliv fosforylace na regulaci Rho-GTPáz
Novotná, Michaela ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Hála, Michal (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá regulací aktivity Rho GTPáz. Rho GTPázy jsou důležité signální proteiny, které se podílí na regulaci a řízení mnoha procesů v buňce. Jedná se například o dynamické změny cytoskeletu (zejména aktinových vláken) spojené s buněčnou adhezí a migrací, dále pak o váčkový transport nebo buněčný cyklus. Aktivita Rho GTPáz je primárně regulována pomocí dalších proteinů ovlivňujících přítomnost GTP/GDP anebo právě pomocí posttranslačních modifikací. Tato práce se zaměřuje na úzký výsek těchto modifikací, na fosforylace. Fosforylace Rho GTPáz totiž ovlivňují mimo jiné jejich aktivitu, lokalizaci a degradaci. Pochopení mechanismu regulace aktivity Rho GTPáz je proto důležité z hlediska porozumění buněčným dějům. Rho GTPázy se podílí například na procesu invazivity nádorových buněk. Studiem Rho GTPáz a jejich regulací lze tak potenciálně nalézr nové cíle léčby nebo předcházet vzniku metastází.
|
|
|
Nekonveční bakteriální signální dráhy
Krupička, Jiří ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Beranová, Jana (oponent)
Dvoukomponentové systémy byly tradičně považovány za hlavní fosforylační systémy bakterií zapojené v buněčné signalizaci. V poslední době se však pozornost stále více soustředí na bakteriální Ser/Thr proteinkinázy eukaryotického typu (eSTKs). Tyto proteinkinázy jsou strukturně podobné svým eukaryotickým protějškům. Některé eSTKs obsahují přídavné domény jako jsou extracelulární PASTA domény, které byly objeveny u různých grampozitivních bakterií. Bylo prokázáno, že tyto domény mohou sloužit jako senzory pro volné peptidoglykanové fragmenty. Naprostá většina vnějších signálních molekul však stále zůstává neznámá. eSTKs fosforylují široké spektrum substrátů, mezi které patří proteiny účastnící se různých buněčných procesů jako je virulence, biosyntéza buněčné stěny, buněčné dělení nebo centrální a sekundární metabolismus. Bylo také popsáno propojení mezi eSTKs a dvoukomponentovými systémy. Tato práce pojednává o současných poznatcích, které se týkají zejména eSTKs a jejich důležitých substrátů, jež byly identifikovány a charakterizovány u různých druhů bakterií.
|
host ::
RSS.