|
|
Využití mikroskopie atomárních sil ke studiu vybraného bakteriálního kmene
Nováková, Simona ; Slaninová, Eva (oponent) ; Smilek, Jiří (vedoucí práce)
Předmětem bakalářské práce bylo studium vybraných bakteriálních kmenů prostřednictvím mikroskopie atomárních sil. Zkoumány byly termofilní purpurové bakterie – Rhodobaca Barguzinensis, Rhodoblastus acidophilus. Hlavním cílem bylo optimalizovat vybranou mikroskopickou metodu pro zobrazení ve vodném prostředí s nejvhodnějším výběrem fixace vzorku. Pro studium bakteriálních kmenů bylo nutné zachovat viabilitu buněčných mikroorganismů a dodržet optimální podmínky pro zachování nativního stavu při procesu měření. Dále byly vyhodnoceny mechanické vlastnosti – Youngův modul a adheze. Morfologie jednotlivých vzorků byla srovnávána u vzorků stejného druhu v odlišném pH kapalného prostředí a v prostředích s různou koncentrací rozpuštěné soli NaCl. Cíleno bylo i na schopnost produkce PHA granulí u purpurových bakterií, ovšem kvůli absenci PHA-syntázy první třídy nebylo PHA detekováno. Byly porovnány vlivy různých parametrů kultivace jako odlišná doba kultivace či rozdílné pH prostředí. Snímkování bakterií probíhalo pomocí hrotu SNL-10, který je vhodný pro bakteriální vzorky v kapalném prostředí a samotné měření probíhalo v módu QITM. K imobilizaci byl použit skleněný substrát pokrytý vrstvou Poly-L-lysinu. Na závěr byly vyhodnoceny mechanické vlastnosti prostřednictvím Youngova modulu a adheze u vzorků s různě proměnlivými faktory prostředí.
|
|
|
Biosyntéza polyhydroxyalkanoátů u nesirných purpurových bakterií
Fiala, Tomáš ; Vodička, Juraj (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce je zaměřena na polyhydroxyalkanoáty (PHA) a jejich produkci pomocí nesirných purpurových bakterií, konkrétně Rhodospirillum rubrum. Proběhla optimalizace kultivačních podmínek pomocí a především stanovení vhodné koncentrace NaCl pro následující evoluční experimenty. U těchto vzorků byl zkoumán růst a produkce PHA pomocí plynové chromatografie s FID detektorem. Poté byl tento mikroorganismus dlouhodobě pasážován o vysoké koncentraci NaCl (40 g/L). Kultivace probíhala v systému pasáží s 48 h intervalem mezi přeočkováním za aerobních podmínek ve tmě. U takto kultivovaných vzorků byla stanovena produkce biomasy a PHA pomocí plynové chromatografie s FID detektorem. Jako poslední experiment byla provedena PCR analýza pro test genů 16S rRNA a phaC. Závěrem práce je provedení úspěšné adaptace R. rubrum na koncentraci 40 g/l NaCl. Dále byl prokázán pozitivní vliv stresového podnětu na zvýšenou produkci PHA u bakterie Rhodospirillum rubrum.
|
|
|
Screening růstu Rhodospirillum rubrum pomocí mikrokalorimetrie
Vetchý, Antonín ; Slaninová, Eva (oponent) ; Krouská, Jitka (vedoucí práce)
Předložená práce se zabývá studiem růstu bakterie Rhodospirillum rubrum pomocí mikrokalorimetrie. Teoretická část se věnuje charakterizaci zkoumaného mikroorganismu a popisu hlavní měřící metody. Pro měření byly zvoleny dva kmeny zmíněné bakterie – divoký kmen (wild type) a mutantní kmen s delecí genu pro PHA syntázu. Nejprve byla provedena optimalizace podmínek měření, kdy byly např. zkoumány různé hodnoty výchozí optické hustoty. Hlavním cílem práce bylo porovnání růstu obou kmenů R. rubrum na různých substrátech lišících se zdrojem uhlíku. K porovnání byly využity křivky normalizovaného tepelného toku získané pomocí mikrokalorimetrie a růstové křivky změřené pomocí tradiční spektrofotometrické metody. Závěrem práce bylo nastavení replikovatelných podmínek měření, které poskytly porovnatelné výsledky pro oba kmeny bakterie. Nejvhodnějším médiem pro nárůst biomasy obou kmenů bakterie Rhodospirillum rubrum se jeví médium SYN FAY, naopak nejméně vhodným se jeví médium SYN AY obsahující acetát, u kterého byly pozorovány jeho částečné inhibiční účinky na růst bakterie. Výsledky analýzy pomocí mikrokalorimetru byly dále potvrzeny a rozšířeny pomocí měření růstových křivek na ELISA readeru.
|
|
|
Optimalizace složení kultivačního média pro termofilní bakterii Caldimonas thermodepolymerans
Fajtová, Zuzana ; Černayová, Diana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předmětem bakalářské práce je optimalizace kultivačních podmínek termofilní bakterie Caldimonas thermodepolymerans. Teoretická část je věnována obecné charakterizaci PHA materiálů, jejich syntéze, degradaci a využití PHA. Dále jsou v teoretické části rozebírány extremofilní mikroorganismy a bakterie C. thermodepolymerans. Experimentální část práce je věnována produkci homopolymeru PHB bakterií C. thermodepolymerans DSM 15344. Bylo provedeno pět experimentů za účelem optimalizace kultivačních podmínek. Zkoumal se vliv teploty, inokulačního poměru, stáří inokula, složení minerálního média a koncentrace zdrojů dusíku v minerálním médiu na růst kultury a produkci PHB. Bylo zjištěno, že původně nastavené podmínky byly už téměř optimální. Vyšší výnos oproti kontrolním podmínkám byl zaznamenán u kombinace 0,5 g/l kvasničného extraktu a 1,5 g/l chloridu amonného, kdy došlo k nárůstu PHB o 7 %.
|
|
|
Prediction of small RNAs in selected bacterial producers of bioplastics
Heřmánková, Kristýna ; Vítková, Helena (oponent) ; Sedlář, Karel (vedoucí práce)
The utilization of bacteria in biotechnology requires a thorough understanding of the capabilities of the bacteria used to maximise the yield. This is applicable, for example, in the production of bioplastics, where competitiveness with cheaper fossil fuel-based plastics depends also on the price of the process to obtain the desired yield. The insight into regulatory mechanisms of bacteria, such as regulation by small RNAs, which ensures a rapid response to stress conditions in particular, can reveal their characteristics and thus assess their use in biotechnology. This thesis deals with bacterial transcriptomic data sequenced with RNA-Seq. Especially, work is focused on the prediction of small RNAs in provided bacterium, a promising candidate for use in biotechnology. The aim is to gain insight into the regulation by sRNAs in this bacterium, in order to analyze the potential regulation of PHA synthesis by small RNAs, which could expand the insight into the utility of the bacterium for PHA production.
|
|
|
Využití molekulárních technik při studiu termofilních mikroorganismů
Dvořáková, Dominika ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Buchtíková, Iva (vedoucí práce)
Polyhydroxyalkanoáty jsou mikrobiální zásobní polymery představující ekologickou alternativu k petrochemickým plastům. Vysoká produkční cena však brání jejich širšímu uplatnění na trhu. Využití odpadních látek jako substrátu a/nebo produkce pomocí extremofilních organismů mohou ovšem výrobní náklady snížit. Rod termofilních bakterií Aneurinibacillus je jedním z potenciálních předmětů zájmu v této oblasti zejména díky schopnosti produkce široké palety netradičních kopolymerů. Zajímavá je i nezávislost syntézy PHA na limitaci živinami, jejíž studium se stalo jedním z hlavních cílů této práce především se zaměřením na expresi genů zapojených do syntézy PHA. Konkrétně byl studován kmen Aneurinibacillus sp. AFn2 na různých typech produkčních médií. Přítomnost vybraných genů byla ověřena pomocí klasické PCR. Následně byly provedeny kultivační experimenty na minerálním a komplexním médiu simulující prostředí s různou dostupností živin. V průběhu měření růstové křivky na obou médiích byla ze vzorků odebíraných v různých časech gravimetricky stanovována koncentrace biomasy a současně s pomocí plynové chromatografie i obsah PHA. Na závěr byla analyzována exprese studovaných genů pomocí RT-qPCR, která odhalila výrazné odlišnosti transkripce jednotlivých genů v závislosti na typu média a na čase kultivace. Výsledky potvrdily, že schopnost produkce PHA u Aneurinibacillus sp. AFn2 není závislá na limitaci živinami, ovšem míra zaplnění buněk produkovaným polymerem s typem média souvisí. Příčinou je pravděpodobně rozdílný průběh exprese genů zapojených do syntézy PHA. Na komplexním médiu bylo pozorováno vyšší procentuální zaplnění buněk polymerem P(3HB) a současně rostoucí trend exprese všech genů. Naopak na minerálním médiu transkripce jednotlivých genů po počáteční silné exprimaci pouze klesala a také zaplnění buněk bylo nižší. Získané poznatky přispívají k pochopení nejen exprese vybraných genů ale také celkové syntézy PHA. Současně otevírají cestu k optimalizaci produkce s cílem snížit výrobní cenu a rozšířit tak jejich uplatnění.
|
|
|
Biotechnologická produkce polyhydroxyalkanoátů pomocí termofilních bakterií
Kouřilová, Xenie ; Patáková, Petra (oponent) ; Koutný, Marek (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Polyhydroxyalkanoáty (PHA) jsou mikrobiální biopolymery, které mohou představovat částečnou alternativu k petrochemicky vyráběným plastům. Jejich hlavní předností je biodegradabilita, biokompatibilita a možnost produkce z obnovitelných zdrojů. Nicméně náklady na jejich produkci jsou stále vyšší než cena polymerů původem z ropy. Pro zvýšení konkurenceschopnosti biotechnologických procesů byl představen koncept Next generation industrial biotechnology (NGIB), který se mimo jiné opírá o využití extremofilních mikroorganismů. Při implementaci extremofilů do fermentačních procesů dochází ke zvýšení robustnosti těchto technologií a zároveň mohou být sníženy nároky na sterilitu. V souvislosti s produkcí PHA pomocí extremofilů je poměrně dobře zmapovaná podskupina halofilních mikroorganismů. Výrazně méně informací je dostupných o další zajímavé kategorii, a to termofilech. V souladu s myšlenkou NGIB se v disertační práci zabýváme produkcí PHA právě pomocí termofilních bakterií. Pozornost je věnována především rodům Caldimonas, Rubrobacter a Tepidimonas. U řady testovaných zástupců těchto rodů byly sledovanými parametry optimální kultivační teplota, vhodný uhlíkatý substrát a schopnost produkce kopolymerů. Na základě tohoto základního screeningu byly vybráni nejslibnější producenti, kteří byli podrobeni dalším experimentům. Předností zástupců rodu Rubrobacter je, že se jedná o gram-pozitivní nesporulující bakterie, jelikož odpadá riziko kontaminace izolovaného polymeru pyrogenními lipopolysacharidy, které jsou přítomné v buněčné stěně gram-negativních mikroorganismů. Bakteriální kmen Tepidimonas taiwanensis LMG 22826T byl schopen produkovat vysoké výtěžky biomasy a PHA na směsi sacharidů glukózy a fruktózy. Při využití extraktu z vinných výlisků bylo dosaženo téměř totožných hodnot jako na čistých substrátech. Termofil Caldimonas thermodepolymerans DSM 15344, původním názvem Schlegelella thermodepolymerans, je velice slibným PHA producentem na substrátech bohatých na xylózu. Těmito substráty mohou být například hydrolyzáty lignocelulózových materiálů, které představují levný zdroj uhlíku. Zda jsou vhodné pro kultivaci C. thermodepolymerans bylo testováno na modelových hydrolyzátech složených z čistých sacharidů. Pro přiblížení reálných vzorků byl také zkoumán vliv potenciálních mikrobiálních inhibitorů vyskytujících se v lignocelulózových hydrolyzátech. V rámci disertační práce byl také vyvinut inovativní izolační protokol k zisku PHA založený na osmotickém namáhání termofilních a halofilních mikroorganismů za zvýšené teploty s přídavkem roztoku povrchově aktivní látky o nízké koncentraci.
|
|
|
Biokrystalizace jako nový koncept vývoje piezoelektrických materiálů pro biomedicínské využití
Dobešová, Kateřina ; Plichta, Tomáš (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřená na metody biofilamentace a biokrystalizace bakteriálních buněk producenta polyhydroxyalkanoátů, konkrétně bakterie Cupriavidus necator H16. Mezi hlavní metody použité na orientaci buněk patří spincoating a akustická vlna. Biokrystalizace byla vyvolána pomocí teplotního, osmotického a acidického stresu. Míra orientace buněk byla sledována mikroskopem atomárních sil, krystalizace pomocí FTIR. Mimo jiné byla určena tloušťka vrstev pomocí profilometru. Množství PHA v bakteriálních buňkách bylo stanoveno pomocí plynové chromatografie. Příprava krystalických uspořádaných vrstev biomateriálů představuje cestu k piezoelektrickým biomateriálům.
|
|
|
Možnosti využití vibrační spektroskopie při in-situ analýze PHA v mikrobiální biomase
Kevélyová, Barbora ; Samek, Ota (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Cieľom tejto diplomovej práce bolo štúdium polyhydroxyalkanoátov v mikrobiálnej biomase pomocou metódy ATR-FTIR. Ďalej bola zvolená štatistická metóda PCA pre vyhodnotenie nameraných dát a pozorované korelácie či odlišnosti. Bakteriálny producenti boli Aneurinibacillus thermoaerophilus H1, AH30 a AFn2, Cupriavidus malaysiensis DSM 25816, DSM 19416 a DSM 19379 a tri kmene Schlegelella thermodepolymerans M 15344, DSM 15264 a LMG 21645. Skúmané boli rozličné heteropolyméry s rôznym obsahom monomérov a celkovým obsahom PHA. Monoméry vo vzorkách boli 3-hydroxybutyrát, 4-hydroxybutyrát, 3-hydroxyvalerát, 4-hydroxyvalerát, 5-hydroxyvalerát a 4-hydroxyhexanoát. Ako porovnávacia analýza pre presné kvantitatívne a kvalitatívne stanovenie polyhydroxyalkanoátov vo vzorkách bola prevedená plynová chromatografia. Spektrá získané metódou FTIR boli porovnávané a boli hľadané signifikantné píky, ktoré súvisia s kvalitatívnymi vlastnosťami PHA, konkrétne monomérnym zložením a stupňom kryštalinity. Na zozbierané dáta z FTIR bola úspešne aplikovaná štatistická metóda PCA, pomocou ktorej boli sledované najmä kvalitatívne rozdiely medzi vzorkami. Najdôležitejšie rozdiely boli pozorované v prípade prítomnosti monoméru 4-hydroxybutyrátu a 4-hydroxyhexanoátu, a týkali sa stupňa kryštalinity vzoriek. Analýza nepreukázala potenciál pri semi-kvantitatívnom stanovení PHA v biomase. Rozdiely medzi mikroorganizmami neboli pozorované. Postup vyhodnotenia FTIR spektier pomocou PCA by bolo vhodné do budúcna využiť pri štúdiu biomasy s obsahom rozličných monomérnych jednotiek, najmä hydroxyvalerátov v prípade ich vyššieho obsahu vo vzorke.
|
|
|
Charakterizace povrchových a mechanických vlastností mikrobiálních buněk
Khýrová, Markéta ; Lukeš,, Jaroslav (oponent) ; Plichta, Tomáš (vedoucí práce)
Předmětem této diplomové práce je charakterizace bakteriálních kmenů schopných produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA) z hlediska morfologie a mechanických vlastností. Za tímto účelem byl použit mikroskop atomárních sil (AFM) spolu s nanoindentačním přístrojem, kde byly provedeny mikrokompresní testy na zvolených mikroorganismech. Modelové bakteriální kmeny, Cupriavidus necator a Rhodospirillum rubrum, byly testovány ve formě produkující PHA i v jejich mutantní variantě PHA neprodukující, za účelem studia vlivu množství PHA na morfologii i mechanické vlastnosti bakterií. Experimentální část této práce zahrnuje nejprve optimalizaci přípravy vzorků nativních bakterií pro obě techniky, kdy byly upravovány skleněné substráty pomocí plazmatu a buňky následně fixovány pomocí Poly-L-lysinu. Pro mikrokompresní testy byla navíc optimalizována i příprava vzorků včetně fluorescenčního barvení s cílem snadné detekce a určení rozměrů buněk. V neposlední řadě byly hodnoceny vlivy různých parametrů měření a výpočetních modelů na data získaná z AFM. Výsledky odhalily vliv PHA na morfologii bakteriálních buněk a ukázaly, že producenti PHA vykazují průměrně vyšší Youngův modul oproti jejich příslušné mutantní variantě. Experimentálně též bylo prokázáno, že mikrokompresní testy poskytují významně vyšší hodnoty Youngova modulu než tato veličina stanovená pomocí AFM.
|
host ::
RSS.