|
|
Targeting insulin storage forms in pancreatic β-cell secretory granules
Asai, Seiya ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Skořepa, Ondřej (oponent) ; Koblas, Tomáš (oponent)
V této disertační práci jsme se zaměřili na komplexní výzkum zaměřený na produkci, skladování a sekreci inzulínu -buňkami pankreatu. Úspěšně jsme vyvinuli nový test pro rychlé a citlivé stanovení koncentrace inzulínu v biologických vzorcích. Tento test, založený na kompetici měřeného vzorku s radioligandem o inzulínový receptor, nám pomohl určit vliv různých nízkomolekulárních látek, ale i peptidů, na sekreci inzulinu. Zjistili jsme, že arginin a ornitin mají na dávce závislý stimulační účinek na glukózou stimulovanou sekreci inzulínu z −buněk, ale že dopamin sekreci inzulinu inhibuje. Účinek serotoninu na sekreci inzulinu byl nejednoznačný. Studovali jsme také účinky kostního proteinu osteokalcinu a jeho fragmentů na sekreci inzulínu. Zjistili jsme, že tyto peptidy nestimulují sekreci inzulinu z -buněk, ale že osteokalcin může mít proliferační vlastnosti. Testovali jsme také vliv tryptofanu a jeho metabolitů a zjistili jsme, že tyto sloučeniny nestimulují sekreci inzulinu, ale že některé z nich ji mohou ve vyšších koncentracích sekreci inhibovat. Významným výsledkem studie je experimentální potvrzení přítomnosti krystalického inzulinu v sekrečních granulích -buněk. Jedná se o první přímý důkaz, že za nativních podmínek může být inzulín v buňkách uložen ve formě mikrokrystalů. Celkově jsme...
|
|
|
Structural biochemistry of human NK cell receptor complex NKp30 and B7-H6
Skořepa, Ondřej ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Přirozeně zabíječské buňky (zkráceně NK buňky) jsou lymfocyty nespecifického imunitního systému, které vynikají schopností rychle rozpoznat a eliminovat infikované, či nádorové buňky. Přestože jejich schopnost imunitního dohledu nad maligní transformací byla potvrzena již před lety, aktuální výzkum stále ukazuje, že tento proces je velice komplikovaný. NKp30 je jedním z hlavních aktivačních receptorů NK buněk s potenciálem k využití v cílené imunoterapii. Ektodoména NKp30 v roztoku oligomerizuje, tento jev ovšem závisí na přítomnosti C-koncového "stalk" regionu. Struktura oligomerů NKp30 a jejich role v přenosu signálu je zatím nejasná. Interakce NKp30 s ligandy je navíc ovlivněna přítomností N-vázané glykosylace. V rámci této práce jsme zjišťovali, zda a jak oligomerizace NKp30 závisí na jeho glykosylaci. Naše výsledky ukazují, že NKp30 tvoří oligomery, ať už je na něm glykosylace přirozená, či jednoduchá (získaná expresí v linii HEK293S GnTI- ). Oproti tomu bylo zjištěno, že NKp30 tvoří pouze monomery, je-li enzymaticky deglykosylováno. Dále jsme charakterizovali interakci s ligandem B7-H6, opět s ohledem na oligomerizaci a glykosylaci a vyřešili krystalovou strukturu jeho komplexu s glykosylovaným NKp30, díky které jsme odhalili glykosylací indukovanou dimerizaci NKp30. Tato práce přináší nový...
|
|
| |
|
|
Strukturní studium potkaního NK buněčného receptoru NKR-P1B a jeho ligandu Clrb
Skořepa, Ondřej ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
NK buňky vykazují unikátní schopnost rozeznávat a způsobit smrt nádorových, či virem infikovaných buněk bez předchozí senzitizace antigenem. Jejich funkce je regulována vyváženými signály indukovanými aktivačními a inhibičními povrchovými receptory při interakci s ligandy cílové buňky. To může být ilustrováno na potkaním receptoru NKR-P1B a jeho ligandu Clrb, které hrají mimo jiné zásadní roli v odpovědi NK buněk na infekci potkaním cytomegalovirem (RCMV). Během infekce RCMV cílová buňka snižuje expresi ligandu Clrb a tím snižuje inhibiční signál přenášený skrze NKR-P1B do NK buňky, to v ideálním případě vede k aktivaci NK buňky a lyzi infikované buňky. Nicméně, RCMV obsahuje gen pro falešný povrchový receptor - RCTL, který napodobuje Clrb, a tak napomáhá úniku před imunitní odpovědí NK buněk. Zatímco tato úniková strategie byla zaznamenána v kmeni potkanů WAG, ukázalo se, že NKR-P1B homolog z potkaního kmene SD váže pouze Clrb a nerozeznává RCTL. Díky tomu je SD kmen méně citlivý k infekci RCMV. Tato práce si klade za cíl poodhalit molekulární základ NKR-P1B:Clrb receptor- ligandového rozeznávání, přičemž vychází z našich dřívějších úspěšných výsledků získaných pro lidský NKR-P1:LLT1 receptor-ligandový pár. Ukázalo se, že pro následnou krystalizaci NK buněčných receptorů a jejich ligandů je...
|
|
|
Příprava lentivirového expresního vektoru s reportérovým genem
Skořepa, Ondřej ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Milichovský, Jan (oponent)
Vedle rekombinantní exprese proteinů v prokaryotických buněčných liniích (E. coli) se dostávají do popředí systémy, které rychle, spolehlivě a stabilně produkují rekombinantní proteiny v lidských buněčných liniích. Ty zaručují vhodnou terciární strukturu a posttranslační modifikace požadovaných produktů. Jednou z možností, jak docílit produkce rekombinantních proteinů v lidských buněčných liniích, je použití lentivirových vektorů. Tato práce popisuje přípravu lentivirového vektoru (plazmidu) Daedalus, který obsahuje konstrukt pro rekombinantní expresi sekretované alkalické fosfatázy. K přípravě požadovaného plazmidu byly použity metody založené na inzerci genu sekretované alkalické fosfatázy pomocí restrikčních endonukleáz a metody, založené na amplifikaci polymerázovou řetězovou reakcí, klonování bez restrikčního štěpení, přenosová polymerázová reakce a Gibsnova reakce.
|
host ::
RSS.