|
|
Vliv vápenatých iontů a cholesterolu na kanálotvornou aktivitu Adenylát-cyklázového toxinu
Doktorová, Eliška ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Horák, Martin (oponent)
1 Abstrakt Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je jedním z hlavních virulenčních faktorů bakterie Bordetella pertussis, která způsobuje onemocnění černý kašel. CyaA působí na hostitelskou buňku dvěma možnými, na sobě nezávislými, způsoby. Jedním je tvorba malých kationt-selektivních kanálů, která může vést až ke koloidně osmotické lyzi cílových buněk. Druhým je rozvrat buněčné signalizace po translokaci adenylát- cyklázové (AC) domény do cytozolu hostitelské buňky, což vede k přeměně ATP na cyklické AMP. V nedávné době bylo dokázáno, že cholesterol má vliv na průběh endocytózy CyaA. CyaA translokuje svou AC doménu až po přesunu celé molekuly CyaA do místa bohatého na cholesterol, tzv. lipidového raftu (Bumba et al. 2010). V této práci jsem se zabývala vlivem cholesterolu na kanálotvornou aktivitu a iontovou selektivitu CyaA kanálů. Pro měření byla užívána umělá membrána obohacená o cholesterol. Kanály CyaA jsou závislé na elektrickém napětí. Pro zabudování molekuly CyaA do membrány je potřeba kladného elektrického napětí na straně toxinu. Snažila jsem se zjistit, zda má hodnota vloženého elektrického napětí na membránu vliv na dobu otevření kanálu a dobu, za kterou se molekula CyaA zabuduje do membrány. Pro toxickou aktivitu CyaA jsou zásadní vápenaté ionty. Jsou potřeba pro hemolytickou aktivitu i pro přenos...
|
|
| |
|
|
Genová exprese porinů a beta-laktamáz během účinku beta-laktamových antibiotik v závislosti na velikosti inokula u klinických izolátů Klebsiella pneumoniae
Hepnar, David ; Žemličková, Helena (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Genová exprese genů porinů a beta-laktamáz během účinku beta- laktamových antibiotik a efekt inokula u klinických izolátů Klebsiella pneumoniae ABSTRAKT V posledních letech narůstá počet publikací, které se zabývají Klebsiella pneumoniae jako jedním z nejvýznamnějších nozokomiálních patogenů a předmětem studií je především narůstající rezistence k širokému spektru antibiotik. Diplomová práce je zaměřena na expresi genů skupiny AmpC - a to β- laktamázy DHA-1 a jejího negativního regulátoru AmpR a současně i porinů OmpK35 a OmpK36 a na efekt inokula. V práci byly použity již dříve charakterizované kmeny Klebsiella pneumoniae. Plazmidy, které byly získány z těchto kmenů byly transformovány do typově odlišných divokých kmenů Klebsiella pneumoniae a následně byla provedena jejich typizace s pomocí pulzní gelové elektroforézy (PFGE) a multilokusové sekvenační typizace (MLST). Pro sledování genové exprese byla použita metoda RT-PCR s použitím specifických primerů a TaqMan sond. Ve většině vzorků byla exprese závislá na přítomnosti induktoru. Vysoce rezistentní kmeny vykazují různý expresní profil, ale exprese blaDHA-1 zůstává indukovatelná cefoxitinem. Různá regulace exprese byla také pozorována u transformantů. Na základě získaných údajů se domníváme, že dříve popsaný regulační mechanismus genů skupiny AmpC není...
|
|
|
The effect of aminoacid variability on the resistance phenotype in ARE subfamily of ABC proteins
Lenart, Jakub ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
ARE podrodina proteinů patřící k ABC transportérům uděluje v různé míře rezistenci k makrolidovým, linkozamidovým a streptograminovým antibiotikům. Mezi klinicky nejvýznamnější proteiny ARE podrodiny u stafylokoků patří Vga(A) protein udílející rezistenci ke streptogtraminům A. V roce 2006 byla objevena jeho nová varianta označována jako Vga(A)LC, která kromě streptograminů A uděluje také rezistenci k linkosamidům. Vga(A) a Vga(A)LC se liší pouze v 7 aminokyselinách, přesto udílejí odlišný rezistenční fenotyp. V předchozích experimentech bylo zjištěno, že centrální roli v určení substrátové specificity hrají 4 aminokyselinové rozdíly, které jsou nahloučené v úseku 15 aminokyselin uvnitř linkeru spojující dvě ABC domény (pozice 212, 219, 220 a 226). Kombinace aminokyselin LGAG z Vga(A) zvyšuje rezistenci k streptogramínům A, zatímco kombinace SVTS přítomná ve Vga(A)LC zvyšuje rezistenci k linkosamidům. Přestože do této podrodiny patří velké množství rezistenčních proteinů, mechanismus rezistence nebyl dosud s jistotou prokázán. Cílem práce bylo vytvoření nových Vga(A) variant, které obsahují kombinace aminokyselin specifických pro Vga(A) a Vga(A)LC protein v pozicích 212, 219, 220 a 226 a porovnání jejich schopnosti udeľovať rezistenci k linkosamidům. Také jsme zkoumali vliv mutací v téže variabilní části...
|
|
|
Umělé lipidické membrány a vlastnosti membránových proteinů
Valášek, Ján ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Buněčná membrána a membránové proteiny hrají v životě buňky fundamentální úlohu. Pomocí transportérů a iontových kanálů komunikují s okolím a udržují buněčnou homeostázu. Proto je jejich poznání a charakterizace významnou oblastí základního i aplikovaného výzkumu. Velké rozměry buňky a nerozpustnost membránových proteinů ztěžují jejich studium a vyžaduje sofistikovanější přístupy, např. pro výzkum jednotlivých kanálů a transportérů. Tato práce se snaží vytvořit jednoduchý přehled nejvíce využívaných metod pro tvorbu umělých lipidických membrán. Jsou jimi LB film, DIB, BLM a SLB. Jejich aplikováním je možné zkoumat lipidové dvouvrstvy a jednotlivé proteiny. Práce dále nastiňuje postup příprav, výhody a využití jednotlivých přístupů a stručně popisuje membránové proteiny, biologické membrány a konvenční metody pro jejich studium.
|
|
|
Vlastnosti membránových pórů tvořených nově objeveným kolicinem FY bakterie Yersinia frederiksenii
Dolejšová, Tereza ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Nunvář, Jaroslav (oponent)
Koliciny jsou toxické extracelulární proteiny, které se uplatňují v mezidruhové i intradruhové konkurenci bakterií. Nově objevený kolicin FY je pórotvorný protein, objevený na Masarykově univerzitě. Je produkovaný kmenem bakterie Yersinia frederiksenii Y27601. Byla prokázána aktivita kolicinu FY proti rodu Yersinia. Porovnáním aminokyselinových sekvencí C-terminálních domén různých kolicinů bylo dokázáno, že kolicin FY je blízce příbuzný kolicinu Ib (Bosák et al., 2012). V této práci jsem se snažila vytvořit stručný a ucelený přehled o skupině kolicinů z pohledu mechanismu jejich translokace přes vnější membránu, následně přes periplazmatický prostor až k inzerci C-terminální domény kolicinu do fosfolipidové dvojvrstvy vnitřní membrány. Dalším cílem bylo obecně shrnout vlastnosti membránových pórů již prozkoumaných kolicinů a porovnat je s čerstvě naměřenými charakteristikami kolicinu FY. Klíčová slova: kolicin, Yersinia, planární lipidové membrány, membránový pór
|
|
|
Působení genotoxického 2-nitrofluorenu a jeho metabolitů na DNA in vivo a možnosti výzkumu tohoto působení pomocí elektrochemických DNA biosenzorů in vitro
Stávková, Klára ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Předkládaná bakalářská práce se zaměřuje na problematiku nebezpečného 2-nitrofluorenu (NF), který je jedním z markerů výskytu nitrovaných polycyklických aromatických uhlovodíků. Shrnuje dosavadní poznatky o vzniku tohoto xenobiotika, jeho výskytu a koloběhu v životním i pracovním prostředí a negativních účincích na živé organismy, především pak na jejich DNA. Tyto poznatky z in vivo studií jsou v předkládané bakalářské práci porovnány s informacemi získanými pomocí elektrochemických DNA biosenzorů, které představují velmi slibnou in vitro alternativu studia dějů probíhajících v živých organismech při interakci xenobiotik s jejich DNA. NF se do ovzduší uvolňuje převážně výfukovými plyny z dieslových i benzínových motorů. Adsorbuje se na pevné prachové částice, pomocí kterých se rozšiřuje na velké vzdálenosti a vstupuje do dýchacích cest živočichů. Atmosférickým spadem přechází NF do vody a půdy, kde je spolu s dalšími živinami a potravou přenášen do rostlin a živočichů a jejich konzumací se poté dostává do těl vyšších živočichů i člověka. Bylo ukázáno, že NF je chemicky stabilní látkou, avšak v organismu podléhá intenzivnímu metabolismu. Metabolity vykazují mutagenní i karcinogenní účinky. Nejnebezpečnějším se jeví 2-acetylaminofluoren. Váže se na DNA a vytváří s ní DNA adukty, které mohou iniciovat...
|
|
|
Faktory interagující s bakteriální RNA polymerázou
Sudzinová, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Bakteriální buňka musí umět rychle měnit svou genovou expresi, aby přežila nestálé okolní podmínky. Nejvýznamnější úrovní, na které dochází ke změnám genové exprese, je transkripce. Klíčovým enzymem transkripce je RNA polymeráza (RNAP), která je regulována transkripčními faktory (TF). Tyto faktory působí na RNAP různými způsoby. V této práci je vytvořen přehled různých bílkovin a jiných faktorů, vlivu jejich funkce na transkripci a mechanismy jejich účinku. Faktory se dají rozdělit podle mnoha kritérií. Hlavním kritériem, podle kterého je sepsána i tato práce, je způsob interakce s RNAP: TF dělíme podle toho, zda se vážou jen na RNAP, nebo vážou DNA a RNAP, nebo interagují s RNA a RNAP. Tato práce přináší ucelený pohled na různé TF, kombinací jejichž působení může bakteriální buňka vytvářet přesnou a žádoucí odpověď genové exprese na změny vyvolané vnějším prostředím.
|
|
|
Fluorescenční studie bakteriálních membránových proteinů a buněčné signalizace.
Fišer, Radovan ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Hof, Martin (oponent) ; Forstová, Jitka (oponent)
(česky) Tato práce shrnuje pět publikací, které se zabývají převážně adenylátcyklázovým toxinem (CyaA) bakterie Bordetella pertussis a jeho interakcí s biologickou membránou. CyaA narušuje buněčné membrány tvorbou malých kationtselektivních kanálů a rozvrací buněčnou signalizaci pomocí enzymu (AC, adenylátcyklázy) přeměňujícího buněčné ATP na cAMP. První studie objasňuje mechanizmus narušování membrány v případě CyaA a příbuzného RTX toxinu, αhemolyzinu (HlyA) produkovaného Escherichia coli. K tomuto účelu byly použity lipozómy jako umělý membránový systém a fluorescenční zhášecí metoda. Oba zkoumané toxiny vykazovaly postupný únik materiálu z lipozómů a rozdílné iontové selektivity (Fišer a Konopásek 2009). Jak doprava AC domény, tak tvorba kanálů jsou závislé na vlastnostech predikovaného transmembránového αhelixu (502522). V naší práci jsme zkoumali další predikovaný transmembránový segment (565591), který nese kyselé zbytky Glu(570) a Glu(581). Většina pokusů byla prováděna na erytrocytech a planárních lipidových membránách. Zjistili jsme, že záporný náboj v pozici 570 je zásadní pro iontovou selektivitu kanálu a je patrně umístěn v blízkosti jeho ústí. Substituce v obou pozicích zásadně ovlivňují schopnost translokace AC domény...
|
|
|
Adaptace cytoplazmatické membrány neprodukčního kmene Bacillus subtilis k surfaktinu.
Stružinská, Olga ; Svobodová, Jaroslava (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Adaptace cytoplazmatické membrány neprodukčního kmene Bacillus subtilis 168 k surfaktinu Surfaktin, jedna z nejúčinnějších povrchově aktivních látek a antibiotikum, je sekundární metabolit bakterií rodu Bacillus. Díky amfipatické povaze interaguje surfaktin s membránovou dvojvrstvou, což vede k její destabilizaci a permeabilizaci. Nabízí se tedy otázka jak se producent surfaktinu toxickému působení této látky brání; mechanizmus rezistence producenta k surfaktinu není doposud znám. Hlavním cílem této diplomové práce byla proto charakterizace adaptivnívh procesů v cytoplazmatické membráně neprodukčního kmene B. subtilis 168, ke kterým dochází v přítomnosti surfaktinu. Kultivace B. subtlis probíhala na živném agaru s přídavkem surfaktinu, který byl získán z produkčního kmene B. subtilis ATCC 21332. Bylo zjištěno, že 400 g surfaktinu/ml inhibuje růst bakterií B. subtilis 168, zatímco 300 g surfaktinu/ml růst stimuluje. Nejprve procházejí obě bakteriální kultury tří hodinovou lag fázi, po které následuje exponenciální růst, a to pomalejší u inhibiční koncentrace a urychlený u stimulační koncentrace surfaktinu oproti kontrole. V přítomnosti obou koncentrací surfaktinu se v cytoplazmatické membráně bakterií zvýšilo zastoupení fosfatidylserinu. Změny zaznamenané na povrchu memrány byly provázeny radikální obměnou...
|
host ::
RSS.