|
|
Transientní transfekce bezsérové buněčné kultury pomocí polyethyleniminů
Čutová, Michaela ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Diplomová práce studuje problematiku transientní transfekce bezsérové buněčné kultury pomocí polyethyleniminů. V teoretické části jsou obsaženy poznatky o vzniku rekombinantních molekul DNA, použití expresních vektorů, přenosu DNA a následné detekci rekombinantního proteinu. Experimentální část byla zaměřena na nalezení vhodné transfekční metody pomocí polyethyleniminu, kdy hostitelskými buňkami byly buňky 293HEK/EBNA. V první části byl zvolen nejúčinnější plazmid – pCEP4/SEAP. Dále byly zkoumány tři transfekční metody: Muller (2005), Durocher et al. (2007) a Backliwal et al. (2008). Nejvyšší dosažené exprese SEAP bylo dosaženo metodou Backliwal et al. (2008).
|
|
|
Bezpečnost probiotik používaných v potravinách
Balažovičová, Nikola ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
V teoretickej časti práce je pozornosť zameraná na definíciu probiotík, na ich zdravotné výhody, na probiotické potraviny, na kritéria bezpečnosti probiotík, vrátane metód identifikácie probiotických baktérií. V praktickej časti práce bola pozornosť zameraná na identifikáciu probiotických baktérií obsiahnutých v mliečnom výrobku Actimel. DNA v kvalite vhodnej pre PCR bola izolovaná pomocou magnetických mikročastíc P(HEMA-co-GMA). Identifikácia bola prevádzaná metódou polymerázovej reťazovej reakcie. Gélovou elektroforézou produktu sa potvrdila prítomnosť bakteriálnej DNA pre doménu Bacteria, rod Lactobacillus a druh Lactobacillus casei. Špecifické produkty PCR o veľkostiach 466 bp (doména Bacteria), 250 bp (rod Lactobacillus) a 136 bp (druh Lactobacillus casei) boli detekované po amplifikácii DNA izolovanej z probiotického mliečneho výrobku.
|
|
|
Vývoj protokolu pro transientní transfekci buněčné linie HEK293 EBNA1
Šmíd, Jiří ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Rekombinantní proteiny patří mezi důležité biofarmaceutické produkty používané v biomedicínském výzkumu a při léčbě lidských nemocí. Rekombinantní proteiny lze produkovat ve velkém množství stabilní transfekcí nebo rychlejší cestou přechodné transfekce s menšímy výtěžky. Pro zajištění správné biologické aktivity musí protein být náležitě poskládán a posttranslačně modifikován. Jelikož může být těchto modifikací dosaženo pouze expresí v savčích buňkách, staly se hlavním hostitelem expresí komplexních rekombinantních proteinů. V této diplomové práci je popsána přechodná transfekce buněk HEK 293 EBNA1 za použití lineárních polyethyleniminů (PEI). Tyto buňky byly předem adaptované na suspenzní kultivaci v médiu bez séra. Buňky byly transfekovány plasmidy pcDNA3.1, pCI, pEBSV1, pCEP4, pEAK8 a pcDNA5/FRT/TO, všechny nesly reporterový gen SEAP. K porovnání účinností jednotlivých transfekcí byly měřeny koncentrace exprimované alkalické fosfatázy (SEAP) v buněčném supernatantu. Dalším faktorem, který byl optimalizován, byl použitý poměr DNA:PEI; rovněž byly vzájemně srovnány účinnosti transfekcí při použití dvou různých polyethyleniminů. Nejvyšší dosažená exprese byla 50 mg/l SEAPu při transfekci ve 24 jamkových deskách za poměru DNA:PEI 1:5. Při porovnání všech šesti plasmidů měl nejvyšší expresi plasmid pCEP4/SEAP a to i při převedení transfekčního systému do většího objemu.
|
|
|
Molekulární identifikace vybraných druhů bakterií mléčného kvašení a bifidobakterií v doplňcích stravy
Riegelová, Kristýna ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Probiotické bakterie mléčného kvašení a bifidobakterie jsou přirozenou součástí gastrointestinálního traktu a v současnosti velmi využívané v potravinářském průmyslu ve formě potravinových doplňků. Cílem diplomové práce byla molekulární identifikace bakterií rodu Lactobacillus a Bifidobacterium v komplexních matricích dvou potravinových doplňků. DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk pomocí magnetických částic P(HEMA-co-GMA). Izolovaná DNA byla amplifikována v rodově a druhově specifických PCR. Amplikony byly detekovány pomocí agarózové gelové elektroforézy. Výsledky byly porovnány s údaji deklarovanými výrobcem ve třech různých šaržích.
|
|
|
Monitorování úspěšnosti transfekce buněčné linie 293 HEK
Dvořák, Tomáš ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Diplomová práce je založena na monitorování úspěšnosti transfekce buněčné linie 293HEK. V teoretické části je popsán princip transfekčních metod, buněčné linie, vektory a reportérové geny. V praktické části byly použity buňky HEK293 EBNA1. Byl zkoumán rozdíl mezi plasmidy GFP a EGFP. Dále byly použity různé transfekční regenty za různých kultivačních podmínek.
|
|
|
Zdraví prospěšné bakterie a autenticita mléčných výrobků
Storozhko, Viktoriya ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Probiotika jsou živé mikroorganismy, které mají prospěšné účinky na zdraví člověka po jejich konzumaci. Teoretická část bakalářské práce popisuje vlastnosti a zdravotní účinky probiotik a jejích využití v potravinářství.Experimentální čast byla zaměřena na izolaci DNA z dvou mléčných probiotických výrobků v kvalitě pro PCR. Pomocí metody PCR byla ve výrobcích prokázana přítomnost cílových bakteriálních DNA.
|
|
|
Vývoj rychlé metody cílené mutageneze bakterie Streptococcus zooepidemicus
Černý, Zbyněk ; Španová, Alena (oponent) ; Pepeliaev,, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřena na vyvinutí rychlé metody cílené mutageneze genů Streptococcus zooepidemicus založené na přirozené kompetenci buněk. Na základě experimentálních dat byly vybrány geny pro deleci, které s vysokou pravděpodobností mají vliv na syntézu kyseliny hyaluronové. Byla provedena delece vybraných genů z genomové DNA jako důkaz účinnosti metody, a u rekombinantních kmenů S. zooepidemicus byly sledovány změny koncentrace prekurzorů kyseliny hyaluronové (glukuronová kyselina a N-acetylglukózamin) v čase a výsledná produkce kyseliny hyaluronové.
|
|
|
Nukleové kyseliny jako terapeutické agens
Ráčková, Lucie ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
S rozvojem molekulární biologie dochází i k rozvoji v onkoterapii. Hlavním směrem moderní medicíny je genová terapie. V genové terapii jsou používány dvě kategorie vektorů, a to virové vektory a nevirové vektory. K nevirovým vektorům patří plazmidy. Plazmidová DNA využívána v medicíně musí být dokonale čistá. V současnosti jsou k izolaci a purifikaci plazmidové DNA využívány hlavně chromatografické metody. Výzkum a vývoj se ale zabývá i jinými metodami, například dvoufázovými vodnými systémy a magnetickými nosiči. V experimentální části byla provedena izolace plazmidové pUC 19 DNA z kultury buněk Escherichia coli JM 109 (pUC 19) metodou alkalické lýze. Izolovaná plazmidová DNA byla purifikovaná pomocí třech metod: RNA v plazmidové DNA byla vysrážena chloridem lithným, RNA byla degradovaná imobilizovanou RNázou A a plazmidová DNA byla purifikována pomocí dvoufázového systému. Kvalita izolované plazmidové DNA byla ověřena spektrofotomericky a agarózovou gelovou elektroforézou.
|
|
|
Reverzibilní imobilizace DNA na nově syntetizovaných magnetických nosičích
Kubisz, Petr ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Cílem diplomové práce byla optimalizace izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) s využitím reversibilní adsorpce nukleových kyselin na povrch magnetických nosičů pokrytých funkčními skupinami. K izolaci DNA bylo ověřováno použítí 6 nosičů: P(HEMA-co-GMA) ox, F-kol B 30 ox, F-kol 77 ox, F-kol B100 ox, F-kol 135 ox, pokrytých karboxylovými skupinami a Perovskit 439 (pokrytý silikagelem). Bakteriální DNA byla izolována metodou fenolové extrakce. DNA byla ze vzorků na magnetický nosič reversibilně navázána v prostředí vysoké koncentrace NaCl (5 M) a poly (etylenglykolu) (PEG 6000) o konečné koncentraci 16 % v separační směsi. DNA byla eluována do TE pufru. Kvalita izolované DNA magnetickými částicemi byla ověřená pomocí amplifikace v PCR. Bylo zjištěno, že i když magnetickými nosiči bylo izolováno různé množství DNA, kvalita izolované DNA byla vždy v kvalitě vhodné pro PCR. Nanočástice Perovskit 439 měly proti ostatním magnetickým nosičům nejlepší separační vlastnosti a bylo jimi izolováno největší množství DNA. Pro jejich další využití při analýze reálných vzorků je však třeba tyto částice i metodu izolace dále optimalizovat.
|
|
| |
host ::
RSS.