|
|
Studies towards biological function of ubiquitin E3 ligase Rnf121 in vivo and in vitro
Škarabellová, Kateřina ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
Přestože je RING finger protein 121 (RNF121) vysoce konzervovaná E3 ubiquitin ligáza, a to od Caenorhabditis elegans k člověku, její funkce není moc známá a u vyšších eukaryot byla zatím studována jen na úrovni in vitro. Pro RNF121 byly popsány různé funkce: i) RNF121 funguje jako široký regulátor NF-κB aktivace, ii) ukázalo se, že kontroluje transport membránových proteinů uvnitř buňky, a iii) jeho downregulace vede k apoptóze. Kromě toho může mít RNF121 roli také při rakovině a to na základě nasledovních dat: 16.4-krát vyšší exprese byla zjištěna u pacientů trpících Barrettovým jícnem (prekancerózním stádiem adenokarcinomu jícnu) a tato exprese byla ještě vyšší u adenokarcinomu v porovnání se zdravou populací. Navíc je RNF121 gen lokalizován v kandidátní oblasti DNA obsahující geny, které se mohou účastnit vzniku rakoviny prsu. Za účelem studia fyziologické funkce RNF121, byl v Českém centru pro fenogenomiku připraven myší Rnf121 knockout, který byl dále studovaný v naší laboratoři. Křížení Rnf121+ /- myší poukázalo na prenatální letální fenotyp Rnf121-/- embryí, která odumírala před embryonálním dnem (E) 11.5. Předběžné experimenty provedené v naší laboratoři prokázaly četné vaskulární defekty v homozygotně mutantním embryu, ve žloutkovém vaku a v placentě. Tato diplomová práce byla zaměřena na...
|
|
|
Posttranslational modifications affecting function of nuclear localization signal
Šebrle, Erik ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Venit, Tomáš (oponent)
Transport proteinů do jádra přes jadernou blánu je kontrolovaný převážně prostřednictvím jaderné lokalizační sekvence/signálu (NLS). Jaderný lokalizační signál je bohatý na pozitivně nabyté aminokyseliny arginin a lysin. Bylo zjištěno, že aktivita tohoto jaderného lokalizačního signálu může být regulována prostřednictvím fosforylace serinu v jeho těsné blízkosti. Fosforylace serinu nebo fosfomimetické změny těchto presekvencí (NLS) může představovat důležitý mechanismus regulující lokalizaci proteinu v buňkách v závislosti na jejich buněčné aktivaci. V naší laboratoři byl identifikován protein - Fragile X mental retardation syndrome 1 neighbor (Fmr1nb), jehož buněčná lokalizace může být řízena touto postranslační modifikací.
|
|
|
Postranslation modifications affecting function of nuclear localization signal
Šebrle, Erik ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Venit, Tomáš (oponent)
Transport proteinů do jádra přes jadernou blánu je kontrolovaný převážně prostřednictvím jaderné lokalizační sekvence/signálu (NLS). Jaderný lokalizační signál je bohatý na pozitivně nabyté aminokyseliny arginin a lysin. Bylo zjištěno, že aktivita tohoto jaderného lokalizačního signálu může být regulována prostřednictvím fosforylace serinu v jeho těsné blízkosti. Fosforylace serinu nebo fosfomimetické změny těchto presekvencí (NLS) může představovat důležitý mechanismus regulující lokalizaci proteinu v buňkách v závislosti na jejich buněčné aktivaci. V naší laboratoři byl identifikován protein - Fragile X mental retardation syndrome 1 neighbor (Fmr1nb), jehož buněčná lokalizace může být řízena touto postranslační modifikací.
|
|
|
Generation and analysis of double deficient transgenic mice for kallikrein-related peptidase 5 and kallikrein-related peptidase 14
Hanečková, Radmila ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Fulková, Helena (oponent)
Peptidázy příbuzné kalikreinu (KLK) představují vysoce konzervovanou rodinu serinových pro- teáz. In vitro experimenty naznačují, že KLK peptidázy hrají důležitou roli v řadě fyziologických a patofyziologických procesů. Jejich úloha in vivo ovšem zůstává ne zcela probádaná, částečně i kvůli nedostatku vhodných zvířecích modelů. Cílem této práce je příprava myšího modelu dvojnásobně deficientního na KLK5 a KLK14. Předpokládá se, že KLK5 a KLK14 jsou součástí proteolytických sítí v pokožce, které jsou významné pro udržení homeostáze kůže. Ovšem myší modely deficientní pouze na KLK5 nebo KLK14 vykazují jenom minimální či žádný fenotyp, pravděpodobně kvůli vzájemné funkční kompenzaci na základě podobné substrátové specifity. V této práci popisujeme úspěšné vytvoření myši dvojnásobně deficientní na KLK5 a KLK14. Dvojnásobně deficientní myši nelze snadno získat křížením kvůli přítomnosti genů pro Klk5 a Klk14 ve stejném lokusu na chromozomu 7, proto k tvorbě myšího modelu používáme TAL efektor nukleázy (TALENy) cílené na Klk14, které aplikujeme mikroinjekcí TALENové mRNA do KLK5-deficientních zygot. Dále ukazujeme, že myši dvojnásobně deficientní na KLK5 a KLK14 jsou životaschopné a plodné. Domníváme se, že tyto nové myší modely mohou sloužit jako užitečný experimentální nástroj ke studiu KLK5 a KLK14 in vivo.
|
|
|
Generation of conditional animal mutants to study gene function in vivo
Herrmannová, Pavlína ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Novák, Josef (oponent)
Kondicionální genové zacílování, které dovoluje kontrolovat genetické modifikace v čase a místě, slouží ke studování funkcí genů v určité tkáni či buňkách určitého typu. Genové zacílování může vést k inaktivaci genu pomocí inzerce či delece. Kondicionální genové zacílování využívá různé metody pro tvorbu transgenních zvířecích mutantů, jako například technologii cíleného narušení genů v embryonálních kmenových buňkách, metodu využívající umělé bakteriální chromosomy, či novou revoluční technologii využívající programovatelné nukleázy, která se jeví být účinnější a levnější metodou pro kondicionální genové zacílování. Tato práce usiluje o prezentaci metod a technologií pro tvorbu kondicionálních zvířecích mutantů, o přehled kondicionálních rekombinačních systémů s důrazem na systémy inducibilní, a také o přehled hlavních mezinárodních zdrojů pro mutagenezi hlodavců. Klíčová slova: transgenní zvířecí model, gen, zacílení, kondicionální alela
|
|
|
Genome editing using programmable endonucleases
Hanečková, Radmila ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Sýkora, Michal (oponent)
Programovatelné endonukleázy jsou proteiny schopné rozpoznat specifické sekvence nukleotidů a následně v rozpoznané sekvenci štěpit obě vlákna DNA. Zinc-finger nukleázy jsou široce využívaným nástrojem v genomové editaci, metodě zavádění změn do genomů buněčných liní nebo celých organismů za účelem studia funkce genů. Nedávno se objevily nové typy programovatelných endonukleáz v podobě transcription activator-like effector (TALE) nukleáz a CRISPR/Cas systému. Tyto systémy se od sebe liší z pohledu mechanizmu funkce, dostupnosti, selektivity, frekvence off- targetů a cytotoxicity. V této práci zinc-finger nukleázy, TALE nukleázy a CRISPR/Cas systém porovnáváme a zkoumáme jejich aktuální a možné budoucí využití v široké oblasti výzkumu, který sahá od vývoje geneticky modifikovaných organismů až po genovou terapii. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Generation and analysis of mutant mouse models to study pathophysiological roles of KLK5 and KLK7 in epidermis
Kašpárek, Petr ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Stopka, Pavel (oponent) ; Machoň, Ondřej (oponent)
Peptidázy příbuzné kallikreinu (KLK) představují rodinu vzájemně spřízněných serinových proteáz, které jsou kódovány geny umístěnými v jediném chromozomálním lokusu. Jejich exprese byla popsána v mnoha tkáních a řada experimentů in vitro naznačuje významnou roli KLK v mnoha fyziologických i patologických procesech. Přesto jsou skutečné úlohy KLK v živém organismu stále ne zcela objasněny, což je způsobeno zejména nedostatkem vhodných zvířecích modelů pro jejich studium. Přestože genově-deficientní myší modely pro některé KLK již byly vytvořeny, jejich význam pro objasnění rolí těchto proteáz v komplexním prostředí živého organismu byl jen omezený. Jednou z hlavních překážek je částečný funkční překryv mezi některými KLK. Inaktivace jednoho genu tudíž často nevede ke změně fenotypu v důsledku funkční kompenzace mezi jednotlivými proteázami. Zdá se tedy, že klasické myší modely deficientní pro jeden gen jsou ne zcela vhodným nástrojem pro studium KLK in vivo. V této práci jsme použili TAL efektor nukleázy (TALENy) pro přípravu několika nových mutantních myších linií, které umožňují analýzu komplexních proteolytických sítí tvořených KLK a studium jejich role ve zdravém organismu i během chorobných procesů. Připravili jsme nový model pro Nethertonův syndrom (NS), autosomálně recesivní kožní chorobu způsobenou...
|
|
|
Vliv extracelulární matrix na expresi genů jaterních myofibroblastů
Jiroutová, Alena ; Kanta, Jiří (vedoucí práce) ; Ehrmann, Jiří (oponent) ; Sedláček, Radislav (oponent)
SOUHRN Jaterní hvězdicové buňky (HSC) a jaterní myofibroblasty (MF) jsou považovány za buňky odpovědné za syntézu extracelulární matrix (ECM). HSC a MF se liší lokalizací v jaterním lalůčku i expresí genů. HSC se nacházejí v Disseho prostoru, při poškození jater se aktivují, proliferují a přeměnují se na myofibroblastické buňky. MF jsou heterogenní skupina buněk, byly popsány portální pMF, septální sMF a interface iMF. V portobiliárním prostoru jaterního lalůčku se nacházejí pMF, které se aktivují při ischemii a městnání žluči; sMF se nacházejí uvnitř vazivových sept. Cílem naší práce bylo porovnat změny exprese genů, které provázejí aktivaci HSC in vitro se změnami odehrávajícími se v HSC při vzniku jaterní cirhózy v modelu toxického poškození jater. Expresi vybraných genů jsme sledovali pomocí oligo cDNA arrayí zahrnujících geny kódující proteiny, proteoglykany, cytokiny, růstové faktory a geny související s metabolismem pojiva - metaloproteinasy (MMP). Zajímali jsme se také o chování MF v trojrozměrném kultivačním prostředí - fibrinovém a kolagenním gelu, které lépe simuluje podmínky ve fibrotických játrech. Poškozená jaterní tkáň je nahrazována nejdříve plasmatickým fibrinem a posléze je nahrazena jizvou s převahou kolagenu. Chování a exprese genů MF v trojrozměrném kultivačním prostředí, nebyla dosud...
|
|
|
Characterization of the role of SPINK 6 in the epidermis using transgenic models
Buryová, Halka ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Epidermis tvoří bariéru mezi vnitřním a vnějším prostředím, přičemž celková homeostáze je závislá mezi jiným i na správné obměně keratinocytů. Podstatnou úlohu hrají v tomto procesu serinové proteázy a jejich inhibitory. Aktivované proteázy štěpí desmosomy ve svrchní vrstvě epidermis a umožňují tak odlupování keratinocytů. V nižších vrstvách epidermis jsou proto vylučovány proteázové inhibitory, jejichž funkcí je zabránit předčasné aktivaci proteáz, a tím rozrušení epidermální bariéry. Mezi nejznámější inhibitory v epidermis patří inhibitory serinových proteáz kazálního typu (SPINK). Tato práce je orientována na výzkum myšího SPINK6 in vivo. K tomu účelu jsme pomocí modifikovaného lidského involukrinového promotoru vytvořili transgenní myši exprimující mSPINK6 ve zvýšené míře, přičemž vyšší expresi mSPINK6 na mRNA a proteinové úrovni RNA vykazovaly dvě z pěti trasngenních linií. Ukázali jsme, že transgenní zvířata jsou životaschopní jedinci bez zjevného fenotypového projevu. Na makroskopické úrovni jsme pak popsali mírný fenotyp, který odlišuje transgenní mSPINK6 myši od normálních jedinců. Závěrem lze říci, že mSPINK6 hraje v homeostázi kůže nejspíš pouze minoritní roli, naproti tomu však může být velmi důležitý při specifické obměně epidermální bariéry. Námi připravené mSPINK6 trasngenní myši mohou být...
|
|
|
Generation of transgenic mouse model to study biological role of KLK5 in epidermis
Kašpárek, Petr ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Fafílek, Bohumil (oponent)
Klk5 patří mezi nejvýznamnější proteolytické enzymy v pokožce a podílí se na procesech jako je deskvamace, štěpení antimikrobiálních peptidů nebo indukce zánětlivé reakce. Role Klk5 v epidermis byla dosud popisována na základě experimentů in vitro, je proto nezbytné potvrdit jeho funkci in vivo. Tato práce si kladla za cíl vytvořit metodické postupy pro zacílení genové exprese myších kalikreinů do svrchní vrstvy pokožky a připravit transgenní myší model exprimující mKlk5 v pokožce. Prvním krokem byla příprava transgenních myší exprimujících fluorescenční marker tdTomato pod kontrolou upraveného involukrinového promotoru. Vytvořené transgenní myši vykazovaly expresi proteinu tdTomato výhradně ve svrchních vrstvách pokožky, čímž byla potvrzena vhodnost upraveného involukrinového promotoru pro cílení genové exprese do diferencovaných keratinocytů. Dále byly úspěšně připraveny transgenní myši exprimující mKlk5. Dvě transgenní linie vykazovaly 6-9 násobnou overexpresi mKlk5 na mRNA i proteinové úrovni v porovnání s wt zvířaty, transgenní mKlk5 byl ovšem za fyziologických podmínek přítomen pouze ve formě neaktivního zymogenu. Transgenní myši byly proto podrobeny dvěma modelům způsobujícím defekty v epidermální bariéře a potenciálně vedoucím aktivaci proteáz. Při modelu atopické dermatitidy a hojení ran...
|
host ::
RSS.