|
|
Rekombinantní exprese proteinu NKp46 a jeho ligandu Epa1
Houserová, Jana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
NK buňky (z angl. natural killer cells - "přirozené zabijácké" buňky) jsou buňky nespecifické imunity a hrají důležitou roli v imunitní odpovědi organismu. Tyto buňky jsou schopny spouštět cytotoxické mechanismy při kontaktu s infikovanými, stresovanými či nádorovými buňkami. Spuštění mechanismů závisí na přítomnosti aktivačních a inhibičních ligandů na povrchu buněk. Na povrchu NK buněk jsou aktivační a inhibiční receptory, které po vazbě na příslušné ligandy vysílají signál NK buňce. Jeden z aktivačních receptorů NK buněk je NKp46. Jedná se o receptor ze skupiny NCR (z angl. natural cytotoxicity receptor - receptory přirozené cytotoxicity). Tento receptor má mnoho ligandů a jedním z nich je adhesin Epa1 z kvasinky Candida glabrata. Tato práce se zaměřuje na přípravu plasmidů a produkci extracelulární části receptoru NK buněk NKp46 a jeho ligandu adhesinu Epa1. Interakce receptoru a jeho ligandu bude zkoumána později. Plasmidy obsahující geny NKp46 a Epa1 byly úspěšně připraveny a ověřeny DNA sekvenací. Protein NKp46 byl produkován v eukaryotickém expresním systému buněčné linie HEK293S GnTI- . Byla připravena stabilně transfekovaná linie HEK293S GnTI- buněk a protein NKp46 byl následně extracelulárně sekretován a izolován z kultivačního média pomocí chelatační afinitní chromatografie a následně...
|
|
|
Úloha střevní mikroflóry v metabolismu léčiv a karcinogenů
Hucková, Pavlína ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Střevní mikroflóru lze považovat za další velmi rozsáhlý orgán lidského těla, který stále není dostatečně prozkoumán. Jedná se o velmi složitý systém s mnoha funkcemi pro hostitelský organismus. Obsahuje velké množství bakterií, virů nebo archea. Střevní mikroflóra má důležité funkce v rozkladu potravin a metabolismu cizorodých látek. Cizorodé látky mohou mít pozitivní, ale i negativní vliv na bakterie střevní mikroflóry. Proto se výzkum zaměřuje na metabolismus těchto látek a zkoumá jejich vliv na onemocnění trávicího traktu. Studováno je také ovlivnění diverzity střevních bakterií, což může být důležité při medikaci pacientů. Odebrané fekální vzorky (A, B, C) byly inkubovány v čase 0, 3 a 6 hodin ve dvou médiích (McDougallův pufr a BHI médium). Vzorky z inkubací byly analyzovány metodou RP-HPLC. Byla sledována degradace myricetinu a jeho případná přeměna na dihydromyricetin. Bylo zjištěno, že degradace myricetinu v průběhu 6 hodin byla u všech fekálních vzorků (A, B, C). Nedá se vyhodnotit, jaké médium bakteriím vyhovuje více, jelikož u jednoho fekálního vzorku (A) došlo k rychlejší degradaci myricetinu v McDougallově pufru, než v BHI médiu. Další fekální vzorek (B) naopak rychleji degradoval myricetin v BHI médiu a pomaleji v McDougallově pufru. U posledního fekálního vzorku (C) byla degradace v...
|
|
|
Metabolismus inhibitoru tyrosinkinas lenvatinibu jako protinádorového léčiva s cílenými účinky
Vavrová, Katarína ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Lenvatinib je orálně podávané protinádorové léčivo, jež patří do skupiny inhibitorů tyrosinkinas, které blokují receptory signálních drah a které jsou zodpovědné za vznik a proliferaci různých nádorových onemocnění. Lenvatinib byl v roce 2015 schválen jako léčivo pro léčbu pacientů s progresivním, lokálně se šířícím nebo metastatickým, diferencovaným karcinomem štítné žlázy refrakterním na léčbu radioaktívním jódem. Předkládaná diplomová práce rozšiřuje poznatky o metabolismu lenvatinibu a o enzymech, které jsou zodpovědné za biotransformaci tohoto léčiva. V experimentech in vitro byly použity mikrosomální systémy člověka a potkana, dále pak lidské a potkaní rekombinantní cytochromy P450 (CYP) exprimované v SupersomechTM . Použité potkaní mikrosomální systémy byly isolovány z jater jednak nepremedikovaných potkanů a jednak premedikovaných potkanů induktory jednotlivých forem CYP. Metabolity lenvatinibu byly separovány pomocí HPLC a následně identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie. Za použití potkaních mikrosomálních systémů byly identifikovány ve všech testovaných mikrosomech dva metabolity, konkrétně N-oxid lenvatinibu a O-desmethyllenvatinib. Oba tyto metabolity byly v největším množství produkovány mikrosomálnimi systémy potkanů premedikovaných pregnenolonkarbonitrilem, jež je induktorem...
|
|
|
Vývoj modelového systému pro studium adheze bakterie Burkholderia cenocepacia na plicní epitel pacientů trpících cystickou fibrózou
Volejníková, Anna ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Cystická fibróza (CF) je běžné autozomálně recesivní onemocnění, které nejčastěji postihuje plicní respirační epitel. Vlivem poškození plic dochází k chronické kolonizaci dýchacího ústrojí řadou patogenních mikroorganismů, jako je Pseudomonas aeruginosa nebo Burkholderia cepacia komplex. Vzhledem k závažnosti infekce těmito bakteriemi a jejich rezistenci na většinu používaných antibiotik jsou hledány vhodné léčebné alternativy, jako je například pasivní imunizace pacientů pomocí specifických slepičích protilátek. V této práci byla studována adheze oportunního lidského patogenu Burkholderia cenocepacia na plicní epitel zdravých jedinců a pacientů trpících CF. Cílem bylo vytvořit a optimalizovat vhodný modelový systém pro toto studium. K tomuto účelu byly použity plicní buněčné linie získané od pacienta s cystickou fibrózou (CuFi-1, mutace ∆F508) a nepoškozené plicní linie (NuLi-1). Bakteriální kmeny B. cenocepacia (ST28 a ST32) byly úspěšně fluorescenčně označeny barvivem PKH26 při zachování jejich viability. Dále byla optimalizována metodika fluorescenčního značení buněčných linií CuFi-1 a NuLi-1 pomocí barviva PKH67. Na vytvořeném modelovém systému byla prokázána až trojnásobně vyšší adheze bakterií k buněčné linii CuFi-1 ve srovnání s linií NuLi-1. Jako potenciální terapeutické agens byla v této...
|
|
|
Charakterizace a hodnocení stability olejů z plodů rakytníku
Michalíková, Adéla ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Diplomová práce se zabývá charakterizací rakytníkového oleje, který je v současné době považován za velice užitečný potravinový doplněk. Po shrnutí literárních údajů o rakytníkovém oleji a jeho biologických účincích se práce v experimentální části věnuje srovnání tří komerčně dostupných preparátů z rakytníkového oleje. Základní charakterizace jednotlivých olejů byla provedena titrační metodou pomocí tukových čísel, tedy peroxidového čísla, jodového čísla, čísla zmýdelnění a čísla kyselosti. K další charakterizaci olejů bylo použito spektrofotometrických metod. Výsledky ukazují výrazné rozdíly mezi jednotlivými vzorky olejů. V průběhu skladování se mezi sebou jednotlivé vzorky olejů lišily hodnotami peroxidových čísel a stabilitou. V tomto ohledu měl rakytníkový olej pocházející od firmy Relikt - Art Engel výrazně nižší hodnoty peroxidového čísla (2,95 mekv/kg) ve srovnání s oleji ze společností Elith Phito a Virde, u kterých byly naměřeny hodnoty peroxidového čísla 12,68 a 8,97 mekv/kg. Hodnota peroxidového čísla značky Relikt - Art Engel se v průběhu skladování téměř neměnila. Podobné rozdíly byly zjištěny také při zkoumání kolorimetrických parametrů, kdy tento olej vykazoval mnohem nižší optickou hustotu než ostatní analyzované oleje. Tyto rozdíly mohou být způsobeny rozdílnou technologii výroby...
|
|
|
Dědičné poruchy glykosylace: alfa-dystroglykanopatie
Zdražilová, Lucie ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Alfa-dystroglykanopatie jsou autosomálně recesivně dědičná onemocnění patřící zároveň do skupiny dědičných svalových dystrofií a dědičných poruch glykosylace. V současné době je známo 20 genů, jejichž mutace vedou k tomuto onemocnění. Alfa-dystroglykan je membránový protein, který je posttranslačně modifikován pomocí oligosacharidových řetězců O-glykosidově vázaných přes mannosu. Porucha biosyntézy těchto oligosacharidových řetězců vede k hypoglykosylaci alfa-dystroglykanu, který tak ztrácí schopnost vázat se na lamininové G-domény ligandů extracelulárního matrixu. Tato hypoglykosylace pak vede přímo k nemocím nazývaným alfa-dystroglykanopatie. Nejvážnější formy alfa-dystroglykanopatíí se projevují svalovou dystrofií, oční malformací a poškozením centrální nervové soustavy. Mírnější formy poruchy se mohou projevovat pouze svalovou dystrofií bez dalších klinických příznaků. Diagnostika alfa-dystroglykanopatií je obtížná z důvodu nedostatečné palety biochemických metod, které by usnadnily zacílení vyšetřovacího procesu před molekulárně-genetickou analýzou. Cílem předkládané práce bylo podat přehled o alfa-dystroglykanopatiích se zaměřením na strukturu, úpravu a patologii alfa-dystroglykanu. V experimentální části této práce bylo otestováno použití imunoelektroforetických technik k diagnostické...
|
|
|
Optimalizace exprese fotoafinitních proteinových nanosond lidských strukturních proteinů zubní skloviny
Štrohalmová, Jana ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Zubní sklovina (enamel) je nejtvrdší tkáň těla obratlovců. Je tvořena evolučně vysoce konzervovaným biomineralizačním procesem, který je řízen proteiny mezibuněčné hmoty (extracelulární matrix). Amelogenin (AMEL) a ameloblastin (AMBN) jsou hlavními proteiny a zároveň klíčovými prvky pro správnou tvorbu zubní skloviny. Současně slouží jako molekuly buněčné adheze, které regulují proliferaci a diferenciaci ameloblastů (buněk podílejících se na tvorbě zubní skloviny). Protože AMBN i AMEL patří do rodiny vnitřně neuspořádaných proteinů (IDP, z angl. intrinsically disordered protein), je velice složité najít metodiku umožňující studovat jejich strukturu a molekulární mechanismus působení. Tato bakalářská práce se zabývá optimalizací přípravy fotoaktivovatelných proteinových "nanosond" studovaného ameloblastinu a amelogeninu pomocí rekombinantní exprese v E. coli s inkorporovaným fotoaktivovatelným analogem aminokyseliny (methionin, leucin). Takto připravené proteinové "nanosondy" budou sloužit ke studiu protein-proteinových interakcí v roztoku a k objasnění strukturně funkčních vztahů lidských proteinů zubního enamelu (ameloblastin a amelogenin). Klíčová slova: Zubní sklovina Ameloblastin Amelogenin Fotoaktivovatelné proteinové "nanosondy" Hmotnostní spektrometrie
|
|
|
Interakce vybraných flavonoidů s cytochromy P450 rodiny 2B
Boštíková, Zdislava ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
V současnosti je kladen větší důraz na zdravý životní styl, který zahrnuje mimo jiné i konzumaci přírodních látek ve formě potravních doplňků. Tyto sloučeniny, často flavonoidního charakteru, vykazují různé chemopreventivní účinky, například antioxidační či proti-karcinogenní účinky. Jejich nadměrná konzumace však může mít i negativní dopad na lidské zdraví. Flavonoidy mohou například ovlivňovat koncentraci biotransformačních enzymů cytochromů P450 v buňkách a tím zasahovat do metabolismu cizorodých látek. Takový zásah by pro člověka mohl mít za následek rozvoj karcinogeneze či neúčinnost některých léčiv. Tato bakalářská práce se zabývá studiem schopností dvou flavonoidních sloučenin myricetinu a dihydromyricetinu indukovat a inhibovat cytochromy P450 rodiny 2B. Pomocí metody Western blotu bylo zjištěno, že ani jeden ze zkoumaných flavonoidů nezvyšuje expresi CYP2B1/2 v játrech, myricetin ani v žádné části tenkého střeva. V případě dihydromyricetinu byla pozorována indukce daných cytochromů P450 rodiny 2B ve střední části tenkého střeva. Inhibiční schopnost flavonoidů byla měřena in vitro jako pokles aktivity CYP2B při O-depentylaci 7-pentoxyresorufinu. Byly zjištěny hodnoty IC50 8,8μM pro myricetin a 0,5mM v případě dihydromyricetinu. Klíčová slova: xenobiotika, cytochromy P450, indukce, metabolismus
|
|
|
Vývoj modelového systému pro studium transportu chloridových iontů u buněk plicního epitelu pacientů trpících cystickou fibrosou
Pecková, Kateřina ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
U onemocnění zvaného cystická fibróza dochází k narušení fungování proteinu CFTR, jehož hlavní funkcí je transport chloridových iontů z buňky. Stanovení schopnosti CFTR kanálu transportovat chloridové ionty je považováno za jediný způsob, jak stanovit jeho aktivitu. V této práci byl transport chloridových iontů prostřednictvím CFTR kanálu studován u buněčných linií plicního epitelu zdravých pacientů (NuLi-1) a pacientů trpících cystickou fibrózou (CuFi-1). Pro studium byla vybrána a optimalizována metoda fluorescenčního značení za použití fluorescenčního barviva N- (ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxychinolinu (MQAE), které poskytuje fluorescenci v modré oblasti spektra a je nejcitlivější fluorescenční sloučeninou vůči chloridovým iontům, která byla doposud navržena. V rámci vývoje optimální metody byly pomocí fluorescenčního značení testovány dva způsoby měření transportu chloridových iontů a to stanovení jejich množství uvolněných buňkou do pufru obsahujícího MQAE a stanovení jejich množství v buňce přímo obarvené MQAE. Druhé stanovení se ukázalo jako vhodnější a reprodukovatelnější metoda pro prokázání transportu chloridových iontů. Zároveň byl sledován vliv sloučeniny forskolinu, která zvyšuje intracelulární koncentraci cAMP a tím urychluje otevírání CFTR kanálu, díky čemuž může být ověřeno, zda...
|
|
|
Slepičí protilátky jako prostředek pasivní imunizaci nemocných cystickou fibrosou
Hadrabová, Jana ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Cystická fibróza (CF) je vrozené onemocnění zejména dýchacích cest a zažívacího ústrojí. Přenos je autozomálně recesivní, nemoc spočívá v mutaci genu pro protein CFTR, který funguje jako iontový kanál pro přenos chloridových aniontů. Důsledkem omezení jeho funkce je výrazné zahuštění plicního sekretu, ve kterém se pak snadněji zachytávají a rostou specifické mikroorganismy, zejména Pseudomonas aeruginosa. Infekce je nejprve léčena pomocí antibiotik, bakterie se však vůči nim brzy stávají rezistentní. Vzniká chronický zánět, jehož následkem je jizvení plicní tkáně (fibrosa). Zejména kvůli rezistencím vůči antibiotikům jsou hledány nové metody léčby pacientů s CF. Takovou metodou by mohla být pasivní imunizace pomocí slepičích protilátek IgY, které jsou specifické proti virulenčním faktorům Pseudomonas aeruginosa a jsou schopny je neutralizovat. Tyto protilátky je možné z roztoku pomocí nebulizátoru přeměnit na aerosol, který by mohli pacienti vdechovat. Protože by, vzhledem ke své struktuře, samy mohly potenciálně způsobovat zánětlivé reakce, bylo potřeba vyzkoušet inhalaci zdravými jedinci. K tomu bylo využito potkanů Wistar, jako experimentálního modelu. Nejprve byly protilátky izolovány, pak byl enzymaticky odštěpen fragment Fab a byla provedena purifikace. V inhalačním experimentu byl použit...
|
host ::
RSS.