|
|
Heat-induced stress granules of Saccharomyces cerevisiae.
Groušl, Tomáš ; Hašek, Jiří (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent) ; Sychrová, Hana (oponent)
(česky) Jedna ze základních charakteristik živých organismů je snaha adaptovat se na měnící se životní podmínky. Regulace translace poskytuje rychlý a široce použitelný mechanismus pro realizaci stresem indukovaných změn. Komplexy mRNA molekul a asociovaných proteinů, které se účastní translace a dalších procesů spojených s mRNA molekulami, podléhají vlivem stresu strukturním změnám. Tyto změny mohou vést k akumulaci zmíněných komplexů do struktur vyššího řádu, jako jsou stress granules (stresové granule) nebo processing bodies. O dalším osudu mRNA molekul a některých součástí translačního aparátu buňky za stresu, se rozhoduje prostřednictvím právě těchto akumulací. Ve snaze detailně porozumět úloze stresových granulí v buněčném metabolismu, jsme v naší laboratoři blíže analyzovali teplem indukované stresové granule kvasinkového modelového organismu Saccharomyces cerevisiae. Zjištěním, že se stresové granule tvoří také v tomto jednobuněčném eukaryotickém organismu, jsme přispěli k poznání, že fenomén stresových granulí je evolučně konzervovaný napříč eukaryotickou říší. Teplem indukované stresové granule kvasinky S. cerevisiae se podobají stresovým granulím evolučně vyšších eukaryot složením a v navrhovaných metabolických funkcích. Nicméně, tyto granule jsou také v některých ohledech jedinečné a...
|
|
|
New regulatory mechanisms of microtubule nucleation
Černohorská, Markéta ; Dráber, Pavel (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
SOUHRN Mikrotubuly jsou dynamické cytoskeletální polymery, které jsou nepostradatelné pro základní buněčné aktivity, jako je udržení buněčného tvaru, dělení, prostorová distribuce organel, migrace a transport váčků. Přestože je nukleace mikrotubulů z komplexů -tubulinu základním krokem ve formaci mikrotubulárního cytoskeletu, signální dráhy regulující nukleaci z centrosomů, jsou u interfázních buněk neznámé. V odborných studiích jsem se koncentrovali na tyto regulační mechanismy. V savčích buňkách je -tubulin kódován dvěma geny. Ukázali jsme, že -tubulin 2 je schopen zastoupit -tubulin 1 v nukleaci mikrotubulů. Navíc jsme zjistili, že -tubuliny jsou různě exprimovány během časné embryogeneze a v dospělých tkáních u myší. Na základě těchto nálezů navrhujeme, že savčí -tubuliny jsou v otázce nukleace mikrotubulů funkčně rovnocenné. Aktivace žírných buněk vede k formaci protruzí, které jsou tvořeny mikrotubuly v závilosti na vápníku. Objevili jsme dva signální proteiny, PIX a GIT1, které interagují s -tubulinem a lokalizují se na centrozomu. GIT1 je fosforylován na tyrosinu u aktivovaných žírných buněk a interaguje s -tubulinem v závilosti na vápníku. Navrhujeme novou signální dráhu pro reorganizaci mikrotubulů u žírných buněk, ve které na tyrozinech-aktivované GIT1 a PIX spolupracují s vápníkovou...
|
|
|
Role stresových granulí a 4E-BP v teplem stresovaných buňkách S. cerevisiae
Kolářová, Věra ; Hašek, Jiří (vedoucí práce) ; Zimmermannová, Olga (oponent)
Buňky dokáží reagovat velmi rychle a specificky na stresové podmínky. Jedním z hla- vních regulačních procesů je ovlivnění translace, specificky iniciace translace, zapojením inhibičních faktorů. U kvasinky Saccharomyces cerevisiae jsou známy dva eIF4E va- zebné proteiny (4E-BP), proteiny Eap1 a Caf20, které jsou uváděny jako represory iniciace translace závislé na čepičce na 5' konci mRNA. Mikroskopická fluorescenční analýza in vivo ukázala rozdílnou reakci proteinu Caf20 a Eap1 na tepelný stres (46◦ C, 10 minut). Protein Caf20 neodpovídá na tepelný stres a zůstává difuzní v cytoplazmě, na rozdíl od Eap1, který akumuluje do shluků v blízkosti stresových granulí (SG). Tato práce ukazuje také na zapojení proteinu Eap1 v tvorbě SG, kdy delece genu EAP1 vede k formování drobnějších neostrých granulí. V souladu s pozorováním fluo- rescenčně značeného proteinu Caf20 v reakci na tepelný stres, neovlivňuje delece genu CAF20 tvorbu teplem indukovaných stresových granulí u kvasinky. Pomocí polysomální analýzy bylo ukázáno, že nepřítomnost represoru iniciace trans- lace neovlivňuje globální represi translace v reakci na tepelný stres a translace je umlčena i v nepřítomnosti represoru iniciace translace. Delece EAP1 možná...
|
|
|
Role of translational elongation factors in dynamics of stress granules.
Hlaváček, Adam ; Hašek, Jiří (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
Translační faktor eIF5A se pravděpodobně podílí na iniciaci i elongaci. Existují také zmínky o jeho roli v tvorbě P-bodies. Vzhledem k podobnosti P-bodies a stressových granulí (SGs) jsme se rozhodli otestovat roli eIF5A v dynamice teplem-navozených SGs a jeho důsledky pro zotavení buněk. Pro hodnocení funkce eIF5A v tvorbě SGs byla použita teplotně citlivá (ts) mutanta eIF5A-3 (C39Y/G188D) kultivovaná za permisivní teploty 25řC, s Rpg1-GFP fúzním proteinem jako značkou SGs. Buňky byly vystaveny robustnímu tepelnému šoku 46řC po 10 minut. Schopnost mutovaných buněk přežít byla testována propidium iodidovým barvením a výsevem jednotek tvořících kolonie (CFU). Zjistili jsme, že mutanta eIF5A-3 tvoří teplem navozené SGs, které agregují volněji. To naznačuje, že pro skládání SGs je nutný plně funkční eIF5A. Nicméně mutace nejeví dopad na míru rozpouštění SGs. Testy přežívání ukazují, že mutanta eIF5A-3 je citlivá vůči buněčné smrti obdobně jako WT buňky, avšak její schopnost znovu nastolit proliferaci je znatelně lepší. Pozorovali jsme také ztrátu ts fenotypu eIF5A-3 mutanty. Tyto změny vlastností nebyly způsobeny zpětnou změnou mutované sekvence genů pro eIF5A. Jejich pravděpodobná příčina leží v adaptivní evoluci. Naše výsledky také naznačují účast eIF5A v aktinové dynamice. Navrhujeme, že účast eIF5A v...
|
|
|
Multiple regulatory roles of the transmembrane adaptor protein NTAL in gene transcription and mast cell physiology
Polakovičová, Iva ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Vyklický, Ladislav (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
(CZ) Tato dizertační práce se zaměřuje především na pochopení regulačních úloh transmembránových adaptorových proteinů NTAL ("non-T cell activation linker") a PAG ("phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains") v aktivaci myších žírných buněk. V odborné literatuře existují protikladné studie o úloze proteinu NTAL v aktivační dráze vysoce afinního receptoru pro imunoglobulin E (IgE) (FcεRI). Studie prováděné na žírných buňkách připravených z myší s genovým knockoutem NTALu naznačují, že NTAL je negativní regulátor FcεRI signalizace, zatímco experimenty provedené na lidských žírných buňkách a buňkách bazofilní leukemie potkana s potlačenou expresí proteinu NTAL mu připisují pozitivní regulační roli. Abychom pochopili zapojení proteinu NTAL v FcεRI zprostředkované signalizaci v myších žírných buňkách a určili, zda různé metodiky delece NTALu mají různé fyziologické následky, použili jsme široké spektrum testů. Jako model jsme použili žírné buňky odvozené z kostní dřeně (BMMC) a připravili jsme BMMC z myší NTAL divokého typu ("wild type") a myší s genovým knockoutem NTALu. Pomocí lentivirových vektorů jsme transdukovali část buněk divokého typu vektorem nesoucím NTAL shRNA ("short hairpin RNA") pro generování buněk s potlačenou expresí NTALu ("knockdown") nebo prázdným...
|
|
|
Function of phospholipases D and lipid phosphate phosphatases in the regulation of plant cell morphogenesis
Bezvoda, Radek ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Vaňková, Radomíra (oponent)
Souhrn práce Předkládaná práce se zabývá funkcí a regulací vnitrobuněčné signalizace, které se účastní fosfolipázy D (PLD) a fosfatidová kyselina (PA), a to zejména v kontextu buněčné morfogeneze rostlin. Fosfolipázy D štěpí membránové fosfolipidy za produkce fosfatidové kyseliny, která má významné biofyzikální a signalizační funkce v mnoha kontextech, jako je například odpověď na stres, regulace dynamiky cytoskeletu a regulace váčkového transportu. Váčkový transport hraje nezastupitelnou roli v ostře lokalizované expanzi buněk pylové láčky a kořenových vlásků. Část práce se věnovala i NADPH oxidázám, u kterých se ukazuje úzká souvislost se signální drahou fosfatidové kyseliny. Pylová láčka tabáku posloužila jako hlavní experimentální model, který umožňuje snadno hodnotit změny v sekretorické dráze při farmakologických a genetických experimentech. Zde se dobře uplatnila metodika cíleného potlačení genové exprese pomocí modifikovaných antisense oligonukleotidů, která byla využita pro snížení exprese izoforem fosfolipázy D, NADPH oxidázy a nově zkoumané rodiny rostlinných lipid fosfát fosfatáz (LPP). Tím se umožnilo hodnocení funkce jednotlivých proteinů v růstu pylové láčky. Při zkoumání uvedených genových rodin byly využity nástroje bioinformatiky, jako je konstrukce dendrogramů, analýza dostupných...
|
|
|
Characterization of the molecular mechanism of translation reinitiation in yeast.
Pondělíčková, Vanda ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Iniciace translace je několika stupňový proces končící sestavením 80S ribozomu umožňujícího elongaci. Při tomto procesu se musí bezchybně složit velká a malá podjednotka ribozomu, mRNA, iniciační Met-tRNAi Met a nejméně 12 eukaryotických iniciačních faktorů (eIF). Tato fáze výroby proteinů je také klíčovým místem pro regulaci genové exprese. Naše laboratoř se zaměřuje zejména na iniciační faktor eIF3, který je tvořen více proteiny a uplatňuje se ve většině fází iniciace translace. Odhalili jsme a popsali roli eIF3 v reiniciaci, genově specifickém mechanismu kontroly translace, uplatňujícím se i v regulaci exprese důležitého kvasinkového transkripčního faktoru GCN4. V této práci přináším detailní studii N-terminální domény proteinu Tif32 (podjednotka eIF3a), která umožňuje několik funkcí. Předně ukazujeme, že Tif32-NTD funkčně interaguje s 5' sekvencí krátkého předcházejícího ORF (uORF1) v GCN4 mRNA a umožňuje tak následnou účinnou reiniciaci. V 5' sekvenci uORF1 byly identifikovány čtyři elementy podporující reiniciaci (REI-promoting elements, RPEs) a dva z nich působí v součinnosti s Tif32-NTD. Struktura 5' oblasti byla počítačově modelována a následně experimentálně potvrzena. Společný strukturní motiv byl nalezen i v 5' sekvenci dalšího kvasinkového genu YAP1, který rovněž obsahuje uORF...
|
|
|
Improved Methods of Image Acquisition and Analysis of Tissues and Cells by Confocal and Multi-Photon Microscopy
Chernyavskiy, Oleksandr ; Kubínová, Lucie (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Malínský, Jan (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Vývojová biologie (P1520) Studijní obor: Vývojová biologie (1501V000) Oleksandr Chernyavskiy Zdokonalené metody pro snímání obrazových dat a analýzu tkání a buněk pomocí konfokální a multifotonové mikroskopie Improved Methods of Image Acquisition and Analysis of Tissues and Cells by Confocal and Multi-Photon Microscopy Abstrakt disertační práce Školitel: RNDr. Lucie Kubínová CSc Praha, 2015 Souhrn Cílem této práce bylo vyvinout metody a přístupy snímání mikroskopických obrázků konfokální, multifotonovou mikroskopií a jejich kombinací, s následnou analýzou dat umožňující nové způsoby vizualizace a měření biologických tkání a buněčných struktur ve 3D. Zaměřili jsme se na metody, využívající výhod konfokální a multifotonové mikroskopie. Naším dalším cílem bylo ukázat použitelnost neinvazivních přístupů v aplikacích in vivo, užitečnost a význam těchto metod pro několik konkrétních biologických aplikací, s důrazem na zdokonalené metody snímání mikroskopických obrázků, analýzu a hodnocení reálných biologickych preparátů. Tato práce nebyla zaměřena na řešení konkrétního biologického problému, ale na metodologický přínos pro několik druhů biologických problémů. Ve výsledku bylo vyvinuto několik pokročilých metod snímání multifotonovou mikroskopii....
|
|
|
Study of the organization and dynamics of the membraneless cell compartments
Blažíková, Michaela ; Heřman, Petr (vedoucí práce) ; Cmarko, Dušan (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
doktorské práce Název práce: Studium organizace a dynamiky bezmembránových buněčných kompartmentů Autor: Michaela Blažíková Ústav: Univerzita Karlova v Praze, Matematicko-fyzikální fakulta, Fyzikální ústav UK Vedoucí práce: Doc. RNDr. Petr Heřman, CSc., Univerzita Karlova v Praze, Matematicko-fyzikální fakulta, Fyzikální ústav UK Abstrakt Eukaryotické buňky obsahují množství organel a specifických tělísek. Kromě organel ohraničených membránou jako je např. buněčné jádro, mitochondrie nebo Golgiho aparát, jsou v buňkách i strukturně a funkčně rozlišené bezmembránové struktury. Tato práce se zabývá samo- organizačními procesy, tj. procesy nevyžadujícími specifické interakce, bezmembránových struktur v jádře, cytoplazmě a plasmatické membráně savčích buněk a kvasinek. Konkrétně se jedná o výzkum formace jadérek a Cajalových tělísek v savčím buněčném jádře a processing bodies (P-bodies) v cytoplasmě savčích buněk. Byla též studována organizace MCC domén v plasmatické membráně kvasinek (Membrane compartment of Can1). Bylo ukázáno, že nespecifické interakce v důsledku molekulárního crowdingu mohou být jednou z hlavních hnacích sil formování a stabilizace těchto vysoce dynamických struktur.
|
|
|
Conventional and Novel Functions of the Exocyst Complex in Plants
Kulich, Ivan ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Baluška, František (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
Exocyst je oktamerický proteínový komplex, konzervovaný naprieč ríšou Eukaryota. Jeho úloha, pôvodne popísaná u kvasiniek, spočíva v pútaní sekretorických váčkov k plazmatickej membráne pred samotným splynutím dvoch membrán. Podjednotky exocystu SEC3 a EXO70 sú považované za tie, ktoré určujú miesto pútania váčku k plazmatickej membráne. Zatiaľ čo genóm kvasinky obsahuje jedinú podjednotku EXO70, u suchozemských rastlín ich nájdeme desiatky (23 u Arabidopsis). Táto práca sa zaoberá úlohou komplexu exocyst v rastlinnej bunke. Jej prvá časť dokladá, že exocyst sa významne podieľa na sekrécii komponentov bunkovej steny, obzvlášť pektínov, ale aj pri hrubnutí bunkovej steny vyvolanom interakciou s patogénom. Ďalšia časť odhaľuje novú, nekonvenčnú úlohu podjednotky EXO70B1 (a na nej založenom subkoplexu) pri autofagickom transporte do vakuoly a vyvoláva tak mnoho otáznikov nad rastlinnou sekretorickou dráhou a jej špecifikami.
|
host ::
RSS.