|
|
Vliv vybraných endokrinních disruptorů na cytochromy P450 1A1 a 2C
Klusoňová, Zuzana ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Linhartová, Lucie (oponent)
Mnohé v současnosti produkované chemické látky patří do skupiny tzv. endokrinních disruptorů (ED). Jde o sloučeniny vykazující exogenní hormonální aktivitu. Ty zpravidla působí jako antagonisté nebo agonisté endogenních hormonů. Mezi zástupce exogenních ED studovaných v této práci patří 17α-ethinylestradiol (EE2) a benzoapyren (BaP). Pro srovnání byl navíc zařazen 17β-estradiol (E2), jako zástupce látky endogenního typu. V bakalářské práci byl studován vliv těchto endokrinních disruptorů a jejich kombinací na expresi a specifické aktivity cytochromů P450 (CYP) 1A1 a 2C. V rámci této práce byla izolována mikrosomální frakce (MF) jater, ledvin a plic potkanů nepremedikovaných a premedikovaných uvedenými sloučeninami. Ve vzorcích MF byla stanovena míra exprese CYP metodou Western blot a pomocí přeměny specifických substrátů uvedených izoforem CYP stanovena jejich aktivita. Bylo potvrzeno, že BaP indukuje expresi CYP1A1 ve všech zmiňovaných orgánech a to i v kombinaci s exogenním EE2 a endogenním E2. Avšak samotný EE2 a E2 míru exprese tohoto enzymu prakticky neovlivňuje. Dále bylo zjištěno, že dochází k mírnému zvýšení exprese i specifické aktivity CYP2C11 u vzorků mikrosomální frakce jater potkanů premedikovaných EE2 a jeho kombinací s BaP. Premedikace laboratorního potkana BaP významně zvyšuje...
|
|
|
Možné přístupy ke genové terapii Cystické fibrosy
Král, Jan ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
1 Abstrakt Cystická fibróza je autosomálně recesivní onemocnění způsobené mutací v CFTR genu, která má za následek nefunkčnost či absenci CFTR chloridového kanálu. Jeden ze způsobů, jak indukovat tvorbu CFTR proteinu v postižených buňkách, představuje genová terapie. V rámci genové terapie lze do cílových buněk přenášet buď DNA, nebo mRNA. Tato práce byla zaměřena na optimalizaci metody detekce CFTR proteinu pomocí metody Western blot, díky níž byla studována účinnost přenosu CFTR-mRNA do buněčných linií. CFTR protein byl detekován v buněčné linii zdravého plicního epitelu (NuLi-1), plicního epitelu postiženého cystickou fibrózou s mutací ΔF508 (CuFi-1) a v buněčné linii plicního karcinomu (A549). Byla porovnávána účinnost čtyř způsobů buněčné lyze - lyze pomocí ultrazvuku a lyze třemi různými lyzačními pufry. Jako nejúčinnější pro detekci tohoto proteinu se ukázala lyze RIPA pufrem s inhibitory proteas. Zároveň byly porovnávány tři primární monoklonální protilátky pro detekci CFTR proteinu metodou Western blot. Z těchto protilátek se ukázala jako nejvhodnější protilátka CF3, která je specifická proti extracelulárnímu epitopu CFTR proteinu. Byly detekovány různě glykosylované formy CFTR proteinu. Největší množství CFTR protein bylo zjištěno v buněčné linii NuLi-1. Zároveň byl tento protein detekován v...
|
|
|
Příprava a biochemická charakterizace proteasového inhibitoru equistatinu
Polatová, Daniela ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Equistatin ze sasanky koňské (Actinia equina) obsahuje proteinovou doménu Eqd2, která inhibuje aspartátové peptidasy, ale dosud nebyla detailně charakterizována. Rekombinantní Eqd2 byl připraven v kvasinkovém expresním systému a byl navržen protokol pro jeho chromatografickou purifikaci. Pomocí fluorescenčního inhibičního testu byla určena inhibiční specifita Eqd2, která ukázala, že je vysoce selektivním inhibitorem peptidas typu katepsinu D a pepsinu z rodiny aspartátových peptidas A1. Dále byla pomocí gelové chromatografie analyzována tvorba komplexu Eqd2-peptidasa a oligomerizace Eqd2 v roztoku. Za účelem budoucí rentgenostrukturní analýzy Eqd2 byla provedena primární analýza krystalizačních podmínek. Tato práce přináší nové významné informace o Eqd2 jako unikátním typu přirozených inhibitorů aspartátových peptidas. Lze předpokládat, že určení interakčního mechanismu Eqd2 umožní navrhovat jeho syntetická mimetika pro regulaci medicinálně významných peptidas. Klíčová slova: peptidasové inhibitory, proteolytické enzymy, aktivita a inhibice enzymů, rekombinantní exprese, purifikace proteinů, krystalizace proteinů, equistatin
|
|
|
Úloha transportérů draselných iontů v programované buněčné smrti kvasinek
Cmunt, Denis ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Úloha transportérů draselných iontů v programované buněčné smrti kvasinek Abstrakt Programovaná buněčná smrt byla původně spojována pouze s ontogenezí živočichů. Později se ukázalo, že hraje důležitou roli také ve fyziologických procesech. Jak nedostatečná programovaná buněčná smrt, tak její zvýšená míra vedou k patologickým projevům. Termín apoptóza, původně synonymně zaměňován za termín programovaná buněčná smrt, představuje jeden z jejích typů. Ostatní typy programované buněčné smrti nejsou zdaleka probádané tak jako apoptóza. Jejich původní dělení bylo založeno na morfologických znacích, nicméně se přistupuje také k rozlišování na základě biochemických znaků. Programovaná buněčná smrt byla nalezena i v rostlinách, kde plní obdobné funkce jako u živočichů, a překvapivě se vyskytuje i u jednobuněčných organismů. V prokaryotech probíhá jiným mechanismem, ale v jednobuněčných eukaryotech byly objeveny mnohé společné znaky s živočišnou apoptózou. Nicméně jisté rozdíly vedou k používání termínu "apoptóze podobná buněčná smrt". Jedním z nejprostudovanějších jednobuněčných organismů je v tomto ohledu kvasinka Saccharomyces cerevisiae. Obsahuje řadu proteinů homologních s živočišnými proteiny a může sloužit jako modelový organismus k prohloubení znalostí o živočišné apoptóze a k porozumění výskytu takového...
|
|
|
Post-translační modifikace histonů a resistence nádorových buněčných linií
Boleslavská, Barbora ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Resistence nádorových buněk vůči cytostatikům představuje v současné době velkou překážku v úspěšné léčbě nádorových onemocnění. Současný pohled na problematiku chemoresistence zahrnuje pouze genové alterace a selekci mutantních buněk nesoucích relevantní mutaci získanou před terapií. Musíme však rovněž přihlédnout k faktu, že buňky mají schopnost produkovat různé odlišné fenotypy a zároveň tyto fenotypy měnit, a to bez genetické alterace. V práci jsme analyzovali populaci buněk neuroblastomové linie UKF-NB-4, která je schopná přežívat vystavení až 115 násobné hodnotě IC50 vinkristinu (3 μM VCR). Inkubaci v prostředí 3 μM VCR po dobu 48 hodin přežívá 3,7±0,02% buněk z původní populace. Tyto přeživší buňky jsou po převedení do čistého kultivačního média schopny proliferovat a tvořit dceřiné subkolonie. Tyto subkolonie jsou však vůči vinkristinu opět sensitivní. Z výsledků "SNP array" je patrné, že genetický profil buněk neuroblastomové linie UKF-NB-4 a profil buněk téže linie, jež přežily inkubaci v prostředí 3 μM VCR po dobu 48 hodin, nejsou geneticky odlišné. Buňky, jež přežily kultivaci v prostředí 3 μM VCR po dobu 48 hodin, vykazují na specifických lysinech výrazné snížení hladiny acetylace histonů spolu se zvýšením hladiny methylace histonů. Tyto změny byly pozorovány v případě acH3, acH4,...
|
|
|
CFTR-mRNA: alternativa pro genovou terapii cystické fibrózy
Pecková, Kateřina ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Cystická fibróza je onemocnění, u kterého dochází k mutaci CFTR genu kódujícího stejnojmenný protein, jehož hlavní funkcí je přenos chloridových iontů. K napravení tohoto defektu byla v rámci diplomové práce vybrána genová terapie. Byly syntetizovány dva typy stabilní mRNA obsahující minimálně 200 adeninů na 3' konci, 25 % pseudouridinu, 25 % 5-methylcytidinu a na 5' konci buďto klasickou čepičku (enzymová mRNA) nebo analog čepičky 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (tzv. ARCA mRNA). Byly použity buněčné linie od zdravých jedinců (NuLi-1) a pacientů trpících cystickou fibrózou s mutací F508del (CuFi-1). Vizualizace CFTR proteinu pomocí optimalizované metody nepřímé imunofluorescence potvrdila zvýšení exprese CFTR proteinu u obou buněčných linií CuFi-1 a NuLi-1, a to jak při použití ARCA mRNA tak při použití enzymové mRNA. Funkčnost CFTR proteinu byla stanovena prostřednictvím fluorescenčního barviva N-(ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxychinolinu (MQAE), kterým byly buněčné linie předem obarveny a které je specificky zhášeno halogenovými ionty. Transport iontů skrze tento kanál byl ověřen použitím CFTR(inh)-172, který specificky tento kanál inhibuje svou vazbou na R doménu. Po 24h transfekci ARCA mRNA buněčné linie CuFi-1 došlo k obnově jeho funkce. V neposlední řadě byla studována adheze bakterií Pseudomonas...
|
|
|
Účinky přírodních látek na viabilitu nádorových buněčných linií
Boleslavská, Barbora ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Nádorová onemocnění jsou jedním z nejzávažnějších problémů současné medicíny a jejich incidence neustále stoupá. Navzdory výraznému rozvoji terapeutických metod v posledních letech jsou tato onemocnění stále velmi obtížně léčitelná. Předkládaná práce se zabývá sledováním účinků přírodních látek - epigalokatechin galátu, kofeinu, etanolového extraktu z Cannabis sativa, vodného extraktu z Origanum acutidens a vodného extraktu z Mentha piperita na lidskou neuroblastomovou buněčnou linii UKF-NB-4. První část práce se zabývá určením viability lidské neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-4 vystavené působení testovaných látek. Dále je studován vliv těchto látek na buněčný cyklus, aktivitu kaspáz a schopnost vyvolat apoptosu. Detekce výše zmíněných charakteristik byla prováděna na buněčném analyzátoru MUSETM a na průtokovém cytometru. Následně byla pomocí metody Western blot sledována hladina proteinu p53 a retinoblastomového proteinu v buněčné linii UKF-NB-4 vystavené působení testovaných látek. Největší vliv měl na viabilitu a buněčný cyklus lidské neuroblastomové buněčné linie epigalokatechin galát. Jeho působením dochází ke snížení viability UKF-NB-4, ke snížení exprese retinoblastomového proteinu a k zadržení přechodu buněk z G0/G1 do S fáze buněčného cyklu. Z výsledků nevyplývá, že by epigalokatechin...
|
|
|
Vývoj modelového systému pro studium transportu chloridových iontů u buněk plicního epitelu pacientů trpících cystickou fibrosou
Pecková, Kateřina ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
U onemocnění zvaného cystická fibróza dochází k narušení fungování proteinu CFTR, jehož hlavní funkcí je transport chloridových iontů z buňky. Stanovení schopnosti CFTR kanálu transportovat chloridové ionty je považováno za jediný způsob, jak stanovit jeho aktivitu. V této práci byl transport chloridových iontů prostřednictvím CFTR kanálu studován u buněčných linií plicního epitelu zdravých pacientů (NuLi-1) a pacientů trpících cystickou fibrózou (CuFi-1). Pro studium byla vybrána a optimalizována metoda fluorescenčního značení za použití fluorescenčního barviva N- (ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxychinolinu (MQAE), které poskytuje fluorescenci v modré oblasti spektra a je nejcitlivější fluorescenční sloučeninou vůči chloridovým iontům, která byla doposud navržena. V rámci vývoje optimální metody byly pomocí fluorescenčního značení testovány dva způsoby měření transportu chloridových iontů a to stanovení jejich množství uvolněných buňkou do pufru obsahujícího MQAE a stanovení jejich množství v buňce přímo obarvené MQAE. Druhé stanovení se ukázalo jako vhodnější a reprodukovatelnější metoda pro prokázání transportu chloridových iontů. Zároveň byl sledován vliv sloučeniny forskolinu, která zvyšuje intracelulární koncentraci cAMP a tím urychluje otevírání CFTR kanálu, díky čemuž může být ověřeno, zda...
|
|
|
Metoda pro studium oxidačního stresu onkologických pacientů pomocí průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí
Zítka, Ondřej ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Název práce: Metoda pro studium oxidačního stresu onkologických pacientů pomocí průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí ABSTRAKT Oxidační poškození organismu a jeho mechanismy jsou jedním z dlouhodobých cílů studia v oblasti biochemie. Látky způsobující toto poškození, kde jsou nejčastěji skloňovány kyslíkové radikály, působí na molekuly v organismu včetně těch nejdůležitějších biomolekul jako DNA. Díky tomu dochází k přeměnám nukleových bazí v samotném řetězci nukleotidů na jejich analogy a tím může být pozměněna funkčnost genetického kódu, což může vyústit v patologické jevy. Cílem této práce je ukázat vhodnost využití elektrochemických metod pro citlivou detekci produktů oxidace nukleových kyselin jako markeru oxidačního poškození. S využitím metod jako ELISA, průtokový injekční systém a magnetické nanočástice byl navržen senzor pro detekci 8-OHdG jako marker oxidace nukleových kyselin u onkologických pacientů, který byl následně úspěšně aplikován. Pomocí vyvinuté metody byly zanalyzovány vzorky moči u čtrnácti pacientů trpících rakovinou prostaty, kde jsme byli schopni rozdělit pacienty do tří úrovní podle detekované koncentrační hladiny 8-OHdG. Celá metoda je nejen dostatečně citlivá, ale také vhodná pro účely aplikace do mikrofluidního zařízení zvaného "Lab on a chip". Metoda a její...
|
|
|
Purifikace monoklonálních protilátek a příprava nosiče pro izolaci glutamátkarboxypeptidasy II z biologického materiálu
Parolek, Jan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
K léčbě benigních i maligních nádorových onemocnění je žádoucí hledat specifičtější, méně zatěžující druhy léčby. Jedním z cílů vylepšení metod léčby neoperovatelných nádorů je co nejmenší poškození okolních zdravých tkání při likvidaci nádoru. Značný pokrok nastal při výzkumu a aplikaci protilátek, jež mohou buňky exprimující určité struktury nejen označit, ale i přímo likvidovat. Nádorové buňky se však od těch zdravých liší jen velmi málo. Tento fakt představuje hlavní problém při léčbě, protože většina látek toxických pro nádor v různé míře negativně ovlivňuje celý organismus. Z tohoto důvodu je nutné hledat nové markery pro léčbu rakovinných onemocnění. Monoklonální protilátky je možné spojit s molekulou léčiva (cytotoxická substance, radionuklid aj.). Vzniklé konjugáty jsou z hlediska léčby nádorů velmi perspektivní, protože protilátka vyhledá cílovou strukturu s velkou specifitou a léčivo může být dodáno lokálně, s minimální zátěží pro organismus pacienta. Jedním ze specifických markerů nádorových onemocnění prostaty se stala glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII), integrální membránový protein vysoce exprimovaný epiteliálními buňkami karcinomu prostaty. K dalšímu zkoumání GCPII je nutné mít k dispozici dostatečně čisté protilátky. Monoklonální protilátky proti GCPII s označením GCPII-05,...
|
host ::
RSS.