|
|
Rhomboid family intramembrane proteases in prokaryotes: mechanism, substrate repertoires and biological functions in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis.
Began, Jakub ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
(Czech) Proteázy z rodiny rhomboidů patří do rozsáhlé skupiny serinových intramembránových proteáz, které katalyzují proteolytické štěpení membránových proteinů uvnitř jejich transmembránových oblastí, v hydrofobním prostředí lipidických buněčných membrán. Rhomboidové proteázy byly objeveny v roce 2001 v Drosophila. V průkopnické studii (Lee et al.) byla identifikována zásadní role Rhomboidu-1 (Rhom-1), který v rané fázi vývoje oka octomilky aktivuje signální dráhu receptoru epidermálního růstového faktoru. Rhomboidové proteázy, ať už aktivní proteázy (rhomboidy) či jejich katalyticky neaktivní protějšky (rhomboidové proteiny zahrnující iRhomy a Derliny), jsou silně konzervovány, což naznačuje jejich biologickou významnost. Rhomboidy jsou přítomné napříč živočišnými říšemi, od archea po člověka, zatímco proteolyticky neaktivní rhomboidové proteiny jsou přítomné výlučně v eukaryotních organizmech. Rodina rhomboidových proteinů hraje roli v široké škále rozmanitých biologických procesů, jakými je signalizace ve vývoji metazoí, mitochondriální biogenezi kvasinek, invaze protozoálních parazitů do hostitelských buněk, kvalitativní kontrola proteinů v endoplazmatickém retikulu (ER), či bakteriální quorum sensing. Ze strukturního i mechanistického hlediska jsou rhomboidy nejprostudovanějšími z...
|
|
|
Structural and functional study of viral RNA polymerases
Dubánková, Anna ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Plevka, Pavel (oponent)
Virové RNA dependentní RNA polymerázy (RdRp) jsou enzymy nezbytné pro množení RNA virů. Obecná funkce RdRp je pro všechny RNA viry stejná: RdRp rozpozná virovou RNA, nasedne na ni a syntetizuje komplementární řetězec RNA. Série těchto kroků je pro virovou infekci naprosto nepostradatelná. Je důležité si uvědomit, že neinfikovaná buňka RNA nereplikuje. Hostitelská buňka přirozeně neexprimuje žádné RdRp. Pro můj výzkum jsem si vybrala RdRp, protože jsou nezbytné pro virovou replicakci a tudíž excelentní cíl pro virovou terapii. V této studii jsou do hloubky charakterizovány polymerázy z rodiny picornavirů a flavivirů. Picornavirová replikace je lokalizovaná ve viry indukovaných, membránových strukturách, které nazýváme replikační organely (RO). V těchto RO je virová polymeráza lokalizovaná na membráně. Nalezli jsme podmínky, ve kterých se polymeráza váže na membránu. Následně byla studována aktivace picornavirových polymeráz, která je indukována inzercí první aminokyseliny do středu proteinu. V této studii jsou rovněž diskutovány RdRp z rodiny flavivirů, konkrétně z viru žluté zimnice (YFV) a Zika viru (ZIKV). Studie prezentuje první strukturu polymerázy z YFV (v plné délce) a model ZIKV polymerázy v komplexu s RNA. Model ZIKV poskytuje strukturní informaci o aktivním místě potřebnou k "dockingu" ligandů.
|
|
|
Příprava rekombinantních protilátek s využitím metod proteinového inženýrství
Šulc, Josef ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Mikulecký, Pavel (oponent)
Tato práce popisuje tvorbu a vlastnosti disulfidicky stabilizovaného variabilního fragmentu protilátky 5D3 specificky rozpoznávající glutamátkarboxypeptidasu II, antigen úzce související s karcinomem prostaty i jinými nádorovými onemocněními. Malé protilátkové deriváty jsou v současnosti masivně využívány pro vývoj diagnostických a terapeutických nástrojů. Některé typy těchto derivátů však vykazují sníženou stabilitu terciární struktury, což může vést k nízkému výtěžku při produkci anebo ke zhoršení až ztrátě funkce proteinu. Tento problém je často řešen zaváděním strukturních změn pomocí proteinového inženýrství. Cílem práce bylo zavedení interdoménového disulfidického můstku do struktury jednořetězcového variabilního fragmentu protilátky za účelem zvýšení jeho stability. Vliv zavedené modifikace na stabilitu proteinu byl posuzován z hlediska výtěžku purifikovaného proteinu a jeho afinity k antigenu. Vyvíjený protilátkový derivát byl produkován v prokaryotickém expresním systému Escherichia coli s využitím signální sekvence směřující produkovaný derivát do periplasmatického prostoru. Snaha o stabilizaci proteinu probíhala pomocí mutageneze na pozicích G44 variabilní domény těžkého řetězce a G100 variabilní domény lehkého řetězce záměnou glycinů za cysteiny. Charakterizace purifikovaného proteinu proběhla s...
|
|
|
Analysis of Histone Deacetylase 6/Kinesin Interactions
Nedvědová, Jana ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Intracelulární transport je zajišťován dvěma typy molekulárních motorů, kinesiny a dyneiny. Kinesin-1 zprostředkovává transport molekul and organel podél mikrotubulů směrem k jejich plus konci. Specifické protein-proteinové interakce jsou nezbytné k aktivaci kinesinu, protože volný kinesin je autoinhibován. Aktivace kinesinu je spojena se změnou jeho konformace. Aktivovaný kinesin se váže na mikrotubuly a za hydrolýzy ATP přenáší navázané molekuly a organely. HDAC6 je multifunkční protein složený z několika domén. Je důležitým regulačním faktorem v mnoha procesech týkajících se mikrotubulů. HDAC6 je totiž hlavním enzymem deacetylujícím mikrotubuly. Bylo popsáno, že inaktivace HDAC6 ovlivňuje transport na mikrotubulech, nicméně mechanismus těchto změn není znám. Inaktivace HDAC6 může tyto změny působit kvůli posttranslační modifikaci mikrotubulů nebo přímou interakcí s molekulárními motory. Tato diplomová práce je zaměřena na charakterizaci dosud nepopsané interakce mezi kinesinem-1 a HDAC6. Za tímto účelem byla provedena exprese a purifikace navržených konstruktů obou proteinů. Tyto konstrukty byly analyzovány pomocí mikroskopické termoforézy (MST) pro stanovení jejich vzájemné afinity a vodík-deuteriové výměny (HDX), kterou byly interakce popsány ze strukturního hlediska. Podle MST je afinita mezi...
|
|
|
Deciphering the biological role of Ddi1-like protein family
Sivá, Monika ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Stopka, Pavel (oponent)
Představitelé rodiny proteinů podobných Ddi1 (z angl. DNA damage-inducible protein homolog 1) patří do skupiny tzv. "přenašečů", které jsou v buňce zodpovědné za regulaci degradace proteinů v ubikvitin-proteasomálním systému. Proteiny podobné Ddi1 se od ostatních přenašečů liší specifickou doménou podobnou retrovirálním proteasam, která patří mezi aspartové proteasy. Nedávno byla v jejich struktuře taktéž objevena vysoce konservovaná helikální doména. V poslední době se objevují studie, které popisují nové funkce členů rodiny protein podobných Ddi1 a to v rámci udržování buněčné homeostázy v odpovědi na stresové podněty, např. v reakci na proteotoxické podmínky nebo v opravě poškozené DNA. Tato disertační práce se zabývá charakterizací vybraných členů rodiny proteinů podobných Ddi1 a to jak na molekulární úrovni, tak v biologických studiích na myších modelech. Byla vyřešena struktura domény podobné ubikvitinu (ubiquitin-like domain, UBL) v rámci kvasinkového proteinu Ddi1. Následně byly porovnány vazebné vlastnosti domén UBL kvasinkového proteinu Ddi1 a lidského proteinu DDI2. Doména UBL a motiv vázající ubikvitin (ubiquitin interacting motif, UIM) lidského homologu DDI2 sice specificky vážou ubikvitin, zároveň je však tato vazba velice slabáv porovnání s jinými ubikvitin vazebnými doménami. Naše...
|
|
|
Generation and Characterization of Glutamate Carboxypeptidase II (GCPII)-Deficient Mice
Vorlová, Barbora ; Šácha, Pavel (vedoucí práce) ; Eckschlager, Tomáš (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII) je transmembránový glykoprotein skládající se z krátké intracelulární a transmembránové domény a velké extracelulární domény, která vykazuje karboxypeptidasovou aktivitu. GCPII se podílí na neuromodulaci v mozku a absorpci folátů v tenkém střevě. Kromě těchto tkání se GCPII též vyskytuje v prostatě a ledvinách. Zde je ale její role neznámá. Za účelem zjištění funkce GCPII se několik vědeckých skupin pokusilo inaktivovat gen Folh1 (kódující GCPII) v myši. Tyto experimenty však vedly k rozporuplným výsledkům. Zatímco dvě studie ukázaly, že inaktivace genu Folh1 v myši vede k embryonální letalitě, jiné dvě studie publikovaly, že i po zmíněné inaktivaci jsou myši stále viabilní a navíc nevykazují žádný výrazný fenotyp. Cílem tohoto projektu bylo pokusit se připravit a charakterizovat myši s inaktivovaným Folh1 genem pomocí alternativní metody genetické modifikace. Za tímto účelem byly vytvořeny TALENy, které specificky cílily 11. exon genu Folh1 v myších zygotách genetického pozadí C57BL/6NCrl. Narozená mláďata generace F0 byla analyzována pro přítomnost mutací v rámci genu Folh1 a myši, které dohromady nesly 5 různých delecí, byly vybrány pro vytvoření mutantních linií. Linie, které nesly mutantní varianty genu Folh1 na obou alelách, neobsahovaly detekovatelnou...
|
|
|
Proteolytické systémy krevničky střevní (Schistosoma mansoni).
Fajtová, Pavla ; Horn, Martin (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Schistosomóza je závažné parazitární onemocnění člověka, jehož původcem jsou krevničky, krevní motolice rodu Schistosoma. Celosvětově je schistosomózou, která představuje globální světový problém, infikováno přes 200 miliónů lidí a dalších 750 miliónů je vystaveno riziku nákazy. Jediný účinný lék pro léčbu schistosomózy je chemoterapeutikum praziquantel, u kterého je riziko vzniku rezistence. Proteasy krevničky představuji nadějné cílové molekuly pro vývoj nových terapeutických strategií proti schistosomóze. Tato práce se zaměřuje na komplexní charakterizaci proteolytických systémů krevničky Schistosoma mansoni a určení jejich role v interakci s hostitelem. Za prvé byly pomocí metod funkční proteomiky popsány hlavní proteolytické aktivity sekretované jednotlivými vývojovými stádii krevničky, která parazitují v těle člověka. Tato analýza prokázala jejich komplexní a specifickou distribuci s převažujícími serinovými a cysteinovými proteasami a metaloproteasami. Za druhé byly pomocí přístupu chemické genomiky identifikovány povrchové a trávicí proteasy krevničky, konkrétně prolyloligopeptidasa a katepsiny typu B, C a D, jako vhodné cílové molekuly pro terapeutickou intervenci. Prolyloligopeptidasa byla biochemicky charakterizována na úrovni rekombinantního proteinu, byly vyvinuty její účinné...
|
|
|
Glutamate Carboxypeptidase II - Structural and Biochemical Characterization and Structure-Assisted Drug Design
Ptáček, Jakub ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Brynda, Jiří (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII) je lidská membránová metalopeptidasa objevená před více než třiceti lety. Od té doby je předmětem zájmu vědců z mnoha odvětví kvůli jejímu výskytu v různých tkáních lidského těla a rozličným biologickým funkcím. Exprese GCPII byla detekována na povrchu astrocytů v centrálním i periferním nervovém systému, kde je zodpovědná za štěpení nejrozšířenějšího lidského peptidového neurotransmiteru N- acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG). Jeden z produktů - glutamát - je významným excitačním neurotransmiterem, jehož nadprodukce (takzvaná glutamátová excitotoxicita) je příčinou smrti neuronů v mnoha neurologických poruchách. Tento jev spolu s neuroprotektivní funkcí NAAG vedl ke zjištění, že inhibice GCPII představuje potenciální terapeutický cíl v těchto poruchách. Rakovina prostaty je druhým nejčastějším nádorovým onemocněním u mužů, a přestože je její progrese relativně pomalá, tak velmi často tvoří metastáze ohrožující život. Ve srovnání se zdravou tkání byla na povrchu nádorových buněk prostaty i metastází pozorována zvýšená exprese GCPII a tedy představuje proteinový marker odlišující zdravé buňky prostaty od nádorových. Toto bylo potvrzeno mnoha publikacemi a využito v několika klinických studiích. Další fyziologickou úlohou GCPII je odštěpování glutamátu z...
|
|
|
Regulace aktivity aspartátových a serinových proteas pomocí selektivních přirozených inhibitorů
Srp, Jaroslav ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Proteasy se účastní řady významných fyziologických procesů a jejich nedostatečná kontrola je spojena s řadou patologií. Přirozené inhibitory představují účinný nástroj pro regulaci jejich aktivity. Disertační práce se zaměřuje na živočišné a rostlinné inhibitory aspartátových a serinových proteas a přináší identifikaci, biochemickou charakterizaci a strukturní popis jejich mechanismu inhibice. Rostlinné inhibitory z Kunitzovy rodiny jsou produkované jako obranné proteiny s unikátní schopností blokovat široké spektrum proteas. V této práci byl s využitím metod funkční proteomiky popsán trávicí proteolytický systém mandelinky bramborové, herbivorního škůdce lilkovitých rostlin. Byl podán přímý důkaz, že trávicí aspartátové a serinové proteasy tohoto herbivora jsou efektivně blokovány pomocí dvou Kunitzových inhibitorů (nazývaných PCDI a PSPI), které jsou produkované v lilku brambor. Pomocí strukturní analýzy byly na molekulách PCDI a PSPI identifikovány nové typy reaktivních center pro inhibici aspartátových proteas typu katepsinu D a serinových proteas typu trypsinu a chymotrypsinu. Popis reaktivního centra na PCDI inhibitoru společně s krystalovou strukturou trávicí proteasy typu katepsinu D mandelinky bramborové umožnilo vysvětlit mechanismus jejich vzájemné interakce. Pro lidský katepsin D byly...
|
|
|
Post-translační modifikace tubulinu
Kropáčková, Veronika ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Dostál, Vojtěch (oponent)
Mikrotubuly složené z heterodimerů αβ-tubulinu jsou nedílnou součástí buněčného cytoskeletu eukaryotických organismů. Podílejí se na transportu, který v buňce probíhá, určují rozmístění membránových organel a utvářejí buněčnou polaritu. Dále jsou součástí dynamických struktur, jako je například dělící vřeténko, ale tvoří také stabilní struktury, jako jsou axonemy bičíků a cilií. Mikrotubuly tedy v buňkách a tkáních zastávají mnoho odlišných funkcí a musí se proto od sebe nějakým způsobem odlišovat. Právě post-translační modifikace molekul αβ-tubulinu v mikrotubulech jsou zdrojem jejich diverzity a definují tzv. "tubulinový kód". Doposud bylo identifikováno dvanáct post-translačních modifikací tubulinu/mikrotubulů. Rozluštění mechanismů, jakými k post-translačním modifikacím tubulinu/mikrotubulů dochází, včetně identifikace odpovědných enzymů, je důležitým zdrojem porozumění dopadu těchto modifikací na biologické funkce. Klíčová slova: tubulin, post-translační modifikace, mikrotubuly, acetylace, tyrosinace, polyaminace, polyglutamylace
|
host ::
RSS.