|
|
Využití kultivačních desek pro tkáňové kultury k testování podmínek exprese rekombinantních proteinů v buněčné linii HEK293
Krzyžanková, Marcela ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Efektivní produkci rekombinantních proteinů (r-protein) předchází testování jejich exprese v malém objemu. Práce byla proto zaměřena na optimalizaci exprese r-proteinů ve 12 jamkových deskách. Optimalizace desek zahrnovala testování vhodné rychlosti třepání, produkčního a transfekčního objemu. Srovnávala jsem stávající testovací nádoby, 50 ml centrifugační tuby, s nově testovanými deskami jako možnou náhradou za nevyhovující tuby. Dalším sledovaným parametrem bylo porovnat nově testované desky s výrobními čtyřhrannými láhvemi s cílem, aby exprese r-proteinu v deskách co nejvíce odpovídala expresi v láhvích. Byl sledován vliv CO2 na počet živých buněk, jejich viabilitu, relativní četnost buněk pozitivních na GFP v různých kultivačních nádobách (desky, tuby, láhve) a doplňkově také pH netransfekované buněčné kultury HEK 293 v průběhu čtyřdenní kultivace. Na základě výsledků a jejich statistického zpracování byly stanoveny pro 12-jamkové desky optimální otáčky 230 rpm a jako vhodný produkční a transfekční objem byl určen 2 a 0,5 ml. Po vyhodnocení proměnných a srovnání kultivací v jednotlivých nádobách, bylo možné tuby nahradit deskami. Statisticky byl prokázán významný vliv CO2 na počet buněk, jejich viabilitu, relativní četnost buněk pozitivních na GFP a pH buněčné kultury HEK 293 v kultivačních nádobách. Nejsilnější exprese r-proteinu bylo dosaženo v prostředí s CO2. Výsledky této práce umožňují aplikovat 12-jamkové kultivační desky pro testování exprese r proteinu v malém objemu v prostředí s CO2. Na základě zjištěných údajů může exprese r proteinu probíhající v deskách v prostředí s CO2 napodobit expresi ve výrobní láhvi bez přítomnosti CO2.
|
|
|
Probiotics in food products for children
Vozárová, Petra ; Kvasničková, Eva (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Despite of the high level of science and medicine, people are trying to return to the nature and use it for their lives. For example, they are using probiotics, which are live cultures able to reside in the human intestine and there can start their role. The teoretical part of this bachelor thesis deals with probiotic bacteria, their properties and those properties which are important in the food industry and the main part focuses on the probiotics used in baby food. The experimental part of the thesis targets on an analysis of two probiotic supplements for children (BioLac Baby and Probacílium+). There was a DNA isolated from these two products by method of phenol extraction and using magnetic media. The whole DNA isolated from these products was amplificated by genus-specific PCR.
|
|
|
Imunomagnetická separace buněk bakterií mléčného kvašení pomocí magnetických nosičů funkcionalizovaných protilátkou
Vaňásek, Jakub ; Španová, Alena (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Imunomagnetická separace je založena na vazbě protilátky s antigenem, kde protilátka je navázána na magnetickém nosiči. V této práci byly pro imunomagnetickou separaci bakterií mléčného kvašení použity částice magnetické perlové celulózy s navázanou protilátkou antiLactobacillus a antiBifidobacterium. Metoda imunomagnetické separace byla nejprve optimalizována a následně byla ověřena účinnost a specifita navázaných protilátek na čistých bakteriálních kmenech a kvasinkách, které byly identifikovány pomocí metody polymerázové řetězové reakce. Účinnost imunomagnetické separace byla rovněž ověřena na masném probiotickém výrobku, ze kterého byly úspěšně izolovány bakterie rodu Lactobacillus. U DNA z těchto vyizolovaných buněk byla provedena vysokorozlišovací analýza křivek tání, pomocí které byla prokázána přítomnost několika kmenů bakterií rodu Lactobacillus.
|
|
|
Studium probiotických bakterií mléčného kvašení produkujících antimikrobiální látky
Turková, Kristýna ; Doležal, Petr (oponent) ; Rada,, Vojtěch (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Soubor 68 kmenů izolovaných ze stolice plně kojených dětí a dalších zdrojů byl identifikován pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) s primery specifickými pro rod Lactobacillus, druhově specifickými primery včetně multiplexní PCR, pheS PCR, rep-PCR, RAPD-PCR a srovnáním sekvencí genů pro 16SrRNA. Dále byla sledována produkce antimikrobiálních látek pomocí agarového kapkového testu a agarového difuzního testu. Antimikrobiální bílkovinné látky v dostatečné koncentraci v supernatantu produkovalo 7 kmenů. U vybraných 3 kmenů byl sledován vliv teploty, pH a přítomnosti detergentů na inhibiční vlastnosti supernatantu. Uvedené kmeny produkovaly teplotně stabilní antimikrobiální bílkovinné látky, jejichž antimikrobiální vlastnosti neovlivňovaly testované detergenty s výjimkou SDS. Skríning DNA na přítomnost genů pro produkci bakteriocinů pomocí PCR a DNA/DNA hybridizace ukázal jejich přítomnost u 14 kmenů. U 3 kmenů byly identifikovány geny shodné s geny v genových klastrech pro gassericin K7A nebo gassericin K7B. Specifické produkty PCR byly sekvenovány a analyzovány pomocí algoritmu BLAST a programu CLUSTAL W2. U 2 kmenů byla nalezena v databázi GeneBank 100% shoda nukleotidových sekvencí se sekvencemi pro části genových klastrů gassericinu K7B, gassericinu T a acidocinu LF221B. Kmeny skupiny Lactobacillus acidophilus byly dále testovány na odolnost vůči podmínkám gastrointestinálního traktu, na adhezi na Caco-2 buňky a na rezistenci vůči antibiotikům. Skríningem DNA všech kmenů pomocí specifických primerů byla zjištěna přítomnost genu pro produkci histidin dekarboxylázy u 7 kmenů, gen pro produkci tyrosin dekarboxylázy byl detegován u 1 kmene a gen pro linoleát izomerázu u 4 kmenů. Pomocí optimalizovaného postupu imunomagnetické separace buněk s využitím biotinylované protilátky anti-Lactobacillus a magnetických nosičů s navázaným streptavidinem byly buňky kmene L. rhamnosus LOCK 0900 separovány z tekutého MRS media, UHT mléka a bílého jogurtu v dostatečném množství pro detekci pomocí PCR.
|
|
|
Izolace DNA s použitím nově syntetizovaných magnetických nosičů
Machan, Radoslav ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Teoretická časť práce bola zameraná na poskytnutie prehľadu základných vlastností magnetických častíc, ich morfológie, základných spôsobov ich syntézy, interakcie s DNA a aplikácie v oblasti biotechnológií a biomedicíny. Cieľom praktickej časti práce bolo overiť použitie novo navrhnutých magnetických častíc pri izolácii laktobacilovej DNA a DNA z teľacieho týmu. Na izoláciu DNA boli použité dva druhy magnetických nosičov: hypersieťované poly(glycidyl methakrylát-co-[2-(methakryloyloxy) ethoxy]octová kyselina-co-ethylen dimethakrylát) mikročastice pokryté amínovými skupinami - P(GMA-MOEAA-EDMA)-NH2 a magnetické neporézne magnetické poly(2-hydroxyethyl methakrylátové) mikročastice pokryté karboxylovými skupinami – P(HEMA-co-GMA)-COOH. Pre každý typ častíc boli testované dva odlišné postupy prípravy separačnej zmesi a dve rôzne koncentrácie poly(etylénglykolu) 6000 (PEG 6000) ako kondenzačného činidla. Medzi oboma typmi magnetických častíc boli zistené rozdiely pri izolácii DNA. Pri oboch typoch častíc bolo dokázané, že za podmienok izolácie pri koncentrácii PEG 6000 8 % sú vhodné na izoláciu DNA v kvalite vhodnej pre PCR.
|
|
|
Využití PCR pro druhovou identifikaci a pro vyhledávání vybraných genů laktobacilů
Diado, Aleksandra ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Probiotické potravinové výrobky - doplňky stravy obsahuji různé druhy probiotických bakterii. Správná druhova identifikace kmenů a jejich charakteristických vlastností je velmi důležitá z hlediska kvality výrobků. K tomu se využívají metody DNA diagnostiky. V této práci byla izolovaná DNA ze 4 probiotických výrobků. Pomocí amplifikace DNA metodou PCR byla ve 3 výrobcích prokázaná přítomnost bakterii rodu Lactobacillus a druhu L. acidophillus, L. casei, L. plantarum, L. rhamnosus v souladu s údaji uvedenými výrobci. Při druhově identifikaci byly pro každý druh použity dvě sady primerů. S využitím dalších primerů byly v DNA izolované z výrobků prokázané sekvence následujících genů: bsh, lai a odc. Byly zjištěny rozdíly mezi výrobky, týkající se detekce lai genu L. acidophillus.
|
|
|
Analýza DNA izolované z probiotických výrobků s využitím magnetických mikročástic
Oliva, Jan ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Tato práce je zaměřena na izolaci a průkaz probiotických bakterií ve třech různých probiotických výrobcích pomocí metody polymerázové řetězové reakce (PCR). DNA v kvalitě vhodné pro PCR byla izolována z hrubých lyzátů buněk pomocí tří druhů magnetických částic a pomocí fenolové extrakce. Identifikace rodů a druhů probiotických bakterií byla ověřena pomocí rodově a druhově specifických PCR. Získané výsledky byly v souladu s údaji prezentovanými výrobci.
|
|
|
Identification of selected genes in lactic acid bacteria
Kristová, Mária ; Vojtíšková, Marie (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Lactic acid bacteria are natural habitants of human gastrointectinal tract. Among the most important are bacteria of genus Lactobacillus and genus Bifidobacterium that contain a lot of probiotic species. Probiotic species are used as food supplements. This work was focused on DNA separation from crude cell lysates of 4 food supplements using magnetic carrier P(HEMA-co-GMA) covered by carboxyl groups. DNA was reversible adsorbed to the carriers in the presence of PEG 6000 (16%) and NaCl (2 M) (final concentrations) and eluted into TE buffer. Lysis of cells from food supplements was performed by lysozyme, SDS and proteinase K. The amount of lysozyme was optimalized. Concentration of separated DNA was measured by spectrophotometric method. The amount of isolated DNA was suitable for PCR. Isolated DNA was used for PCR with universal primers, PCR specific for genus Lactobacillus and genus Bifidobacterium and for 9 different species-specific PCRs: Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei/paracasei, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum and Bifidobacterium infantis. Amplicons were detected by agarose gel electrophoresis (1,8%). It was shown that DNA amplification methods are quick and precise for identification of studied species. The results of bacteria identification were compared with data provided by the manufacturer. In all food supplements, bacteria of genus Lactobacillus and Bifidobacterium were detected. However, only some species provided by manufacturer were identified by PCR in each tablet.
|
|
|
DNA analýza nepatogenních klostridií izolovaných ze sýrů
Chroboková, Maria ; Trachtová, Štěpánka (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je molekulárně genetická metoda, která umožňuje replikaci nukleových kyselin in vitro. Umožňuje identifikaci mikroorganismů nebo prokazování přítomnosti specifických genů v různých matricích biologického původu. Některé nepatogenní druhy rodu Clostridium způsobují vážná poškození sýrů, proto jejich identifikace a kvantifikace je tak důležitá v sýrařství. V této práci byly testovány specifické primery pro rod Clostridium. Byla zde použita bakteriální DNA sbírkových kmenů a kmenů vyizolovaných z poškozených sýrů. Pomocí specifických primerů byly metodou PCR amplifikovány charakteristické úseky DNA pro klostridie. PCR produkty (619 bp) byly detekovány použitím elektroforézy na 1,8% agarózovém gelu. Byla potvrzena rodová specifita testovaných primerů specifických pro rod Clostridium. Pro negativní kontrolu byla použita bakteriální DNA rodu Lactobacillus.
|
|
|
Produkce nanočástic stříbra bakteriemi
Kubínová, Martina ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Nanočástice stříbra a jejich potencionální využití jakož i budoucí vliv na životní prostředí je stále objektem studií. Metodika syntézy nanočástic stříbra je poměrně dobře prostudována a studium se nyní zabývá spíše ekonomičtějšími způsoby syntézy pomocí materiálů, které jsou šetrné k životnímu prostředí a nejsou toxické. Všechny tyto výhody má biochemické produkce nanočástic. Tato práce byla zaměřena především na produkci nanočástic bakteriemi mléčného kvašení a jejich antibakteriální aktivitu. Experimentální část byla zaměřena na izolaci amplifikaci DNA izolované z bakterie Lactobacillus gasseri K7, u které byla potvrzena schopnost tvorby nanočástic. DNA byla izolována v kvalitě vhodné pro PCR, což bylo potvrzeno její amplifikací s primery specifickými pro doménu Bacteria a primery specifickými pro druh Lactobacillus gasseri.
|
host ::
RSS.