|
| |
|
|
Vývoj HPLC-DAD-MS/MS metody pro stanovení vybraných toxinů v Muchomůrce zelené.
Musil, Karel ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent)
(CZ) Tato práce byla zaměřena na vývoj a optimalizaci analytické metodiky, pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s detekcí diodovým polem (HPLC-DAD) a vysokoúčinné kapalinové chromatografie s detekcí diodovým polem a tandemovou hmotnostní spektrometrií (HPLC-DAD-MS/MS), pro stanovení amatoxinů (α- a β-amanitinu) a falotoxinů (falacidinu a faloidinu) v hrubém extraktu z kloubouku muchomůrky zelené. S cílem zaručit spolehlivost analytických výsledků byl studován vliv různých parametrů na kvalitu separace a samotné stanovení. Vyvinutá metoda HPLC-DAD dosahuje dobré linearity v rozmezí koncentrací 1 - 100 µg/ml, kdy korelační koeficienty pro obě kalibrační závislosti všech sledovaný látek jsou vyšší než 0,997. Pro stanovované toxiny byly vypočteny limity detekce (LOD) a kvantifikace (LOQ), pro α-amanitin 0,90 µg/ml (LOD); 2,99µg/ml (LOQ), β-amanitin 1,07 µg/ml (LOD); 3,56 µg/ml (LOQ), falacidin 2,17 µg/ml (LOD); 7,26 µg/ml (LOQ) a faloidin 0,79 µg/ml (LOD); 2,64 µg/ml (LOQ). Klíčová slova: muchomůrka zelená, -amanitin,-amanitin, falacidin, faloidin, extrakce tuhá látka-kapalina, HPLC-DAD, HPLC-DAD-MS/MS
|
|
|
Imobilizace proteasy V8 na magnetických částicích pro použití k proteolytickému štěpení pepsinu A
Čepa, Adam ; Pacáková, Věra (vedoucí práce) ; Tichá, Marie (oponent)
Tato bakalářská práce navazuje na dlouholetý výzkum v oblasti diagnostiky onemocnění žaludku, který je založen na mapování žaludečního enzymu pepsinu A. Bylo zjištěno, že určité fosforylace v primární struktuře tohoto enzymu mohou sloužit jako marker počínající karcinogenity. Tato bakalářská práce je zaměřena na imobilizaci proteasy V8 izolované z mikroorganismu Stafylococcus aureus na agarosových magnetických kuličkách. Proteasa V8 je vhodným kandidátem pro tvorbu peptidové mapy pepsinu A. Byl studován vliv pH, teploty a reakční doby na aktivitu enzymu a určeny optimální podmínky pro hydrolytickou katalýzu tvorby peptidických fragmentů pepsinu A.
|
|
|
Monitorování vybraných steroidních hormonů metodou HPLC-MS/MS a studium jejich vlivu na myší spermie in vitro.
Bosáková, Tereza ; Komrsková, Kateřina (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent)
Tato diplomová práce byla zaměřena na vývoj nové metody využívající vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s tandemovou hmotnostní detekcí (HPLC-MS/MS) pro kvantifikaci vybraných steroidních hormonů, a to 17α-ethynylestradiolu (EE2) a progesteronu (PRG), v M2 fertilizačním médiu. Toto médium je používané při kapacitaci spermií in vitro, což je proces, kdy dochází ke komplexním molekulárně-biochemickým změnám ve spermii, na jejichž základě spermie získávají schopnost oplodnění. Fyziologický průběh tohoto procesu je tudíž zásadní pro získání fertilizační schopnosti samčích gamet. Optimalizované HPLC-MS/MS podmínky (kolona Kinetex EVO C18, mobilní fáze 50/50 (v/v) ACN/H2O, s 0,1% obsahem mravenčí kyseliny v obou složkách, průtok mobilní fáze 0,3 ml/min, nástřik 7,5 µl) byly aplikované pro sledování koncentračních změn jednotlivých analytů během časově závislé kapacitace myších spermií. Testované koncentrace pro EE2 byly 200, 20 a 2 µg/l a pro PRG pouze 200 µg/l. Bylo zjištěno, že nejprve dochází k poklesu koncentrace volného, nevázaného EE2 (minimum okolo 60. min kapacitace) a poté k jejímu opětovnému nárůstu. Tento trend vykazovaly všechny testované koncentrace. Koncentrace (200 µg/l) volného, nevázaného PRG klesala po celou dobu kapacitace. Závislosti koncentrace volného, nevázaného hormonu na...
|
|
|
Characterization of modern HPLC columns and their application potential
Janečková, Lucie ; Tesařová, Eva (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent) ; Flieger, Miroslav (oponent)
(CZ) Cílem předkládané disertační práce byla charakterizace moderních HPLC kolon z hlediska jejich interakčních možností a ukázka jejich aplikačního potenciálu. První část disertační práce je zaměřena na alternativní reverzní HPLC kolony na bázi oxidu zirkoničitého. Tyto kolony vykazují vysokou chemickou stabilitu a rozšířený interakční mechanismus, který přináší řadu výhod při vývoji analytických metod. Detailní studie chromatografického chování biologicky aktivních nonapeptidů potvrdila značný vliv složení mobilní fáze na retenční mechanismus. Pro rozpoznání interakcí podílejících se na separačním procesu byly následně využity různé přístupy. Základní vlastnosti (hydrofobicita a polarita) kolony na bázi oxidu zirkoničitého s polystyrenovou stacionární fází byly zjištěny pomocí jednoduchých chromatografických testů. Model lineárních vztahů volných energií popsal interakce převládající v různých separačních systémech se zirkoniovou kolonou. Aplikace sady bazických látek vedla k odhalení iontově- výměnných interakcí, které se mohou významně podílet na separačním procesu v systémech se zirkoniovými kolonami. Druhá část práce se věnuje novým chirálním stacionárním fázím na bázi derivatizovaných cyklofruktanů. Strukturně odlišné chirální látky (binaftylové deriváty a některá chiralní léčiva) byly...
|
|
|
Vývoj nové metody analýzy nukleotidového fondu v bakteriálních buňkách
Zborníková, Eva ; Rejman, Dominik (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent) ; Kozlík, Petr (oponent)
(CZ) Předkládaná dizertační práce se zabývá stanovením nukleotidů v bakteriálních buňkách. Nukleotidy hrají klíčovou úlohu ve většině metabolických dějů, a proto informace o jejich zastoupení je důležitým vodítkem o vlivu interních i externích podmínek na látkovou přeměnu bakterií. Dosud publikované práce zabývající se analýzou nukleotidů a jiných intracelulárních metabolitů lze rozdělit na dvě skupiny podle používané techniky: a) práce s metabolomickým přístupem a b) práce s úzkou skupinou cílových analytů pro rutinní analýzu. V případě a) většinou autoři využívají nejmodernější techniky LC-MS/MS, v případě b) robustní UV detekci nejčastěji ve spojení s IP-LC. Cílem této práce bylo spojit oba přístupy a získat metodu pro rutinní analýzu, která by ale využívala benefitů hmotnostní detekce, jako je citlivost a selektivita, a zároveň by nevyžadovala náročné optimalizování MS/MS přechodů a odbornou obsluhu. Hlavní záměr nové HILIC-MS metody je její univerzální aplikovatelnost ve většině biologických a biochemických laboratoří.
|
|
| |
|
|
Využití elektroforetických a chromatografických metod pro klinický výzkum
Fauknerová Matějčková, Jana ; Samcová, Eva (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent) ; Křepela, Evžen (oponent)
disertační práce Řešitel: RNDr. Jana Fauknerová Matějčková Téma: Využití elektroforetických a chromatografických metod pro klinický výzkum Malondialdehyd (MDA) je považován za hlavní biomarker oxidativního poškození biomembrán a jeho zvýšená hladina se projevuje u různých onemocnění. Pro stanovení MDA byla použita HPLC metoda s derivatizací vzorku krevní plazmy 2,4-dinitrofenylhydrazinem. Vzniklý derivát MDA lze snadno oddělit pomocí HPLC od ostatních komponent krevní plazmy a detekovat jej při 307 nm. Doba analýzy MDA nepřesahuje 4,5 min. Citlivost (limit detekce 0,27 mol l-1 ) a opakovatelnost stanovení je dostatečná pro monitorování hladiny MDA v reálných vzorcích krevní plazmy. Ve své práci jsem dále sledovala hladiny nízkomolekulárního sekundárního antioxidantu kyseliny močové, jejíž koncentrace v krvi dosahuje 140 až 340 µmol l-1 a sekundárního enzymatického antioxidantu superoxiddismutázy (SOD). Analýza hladin kyseliny močové byla prováděna metodou kapilární elektroforézy a spektrofotometrickou metodou, přičemž obě metody vykazovaly srovnatelné výsledky. Analýza SOD byla prováděna pomocí spektrofotometrického kitu. Hladiny MDA byly proměřovány u veganů (odmítání jakékoliv živočišné stravy, vegani nekonzumují žádné maso ani vejce a mléčné výrobky) s průměrnou hodnotou MDA 5 mol l-1 , což je...
|
|
|
Využití kapilární a čipové elektroforézy pro klinický výzkum
Pavlíček, Václav ; Tůma, Petr (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent) ; Dlouhý, Pavel (oponent)
Předkládaná dizertační práce na téma "Využití kapilární a čipové elektroforézy pro klinický výzkum" je rozdělena na dvě samostatné části. První kapitola shrnuje problematiku vývoje velmi rychlého stanovení kyseliny močové a kreatininu v lidské moči a séru prostřednictvím kapilární elektroforézy s UV detekcí, kdy bylo vyvinuto zcela originální řešení pro provádění desetivteřinové elektroforetické separace na komerčním elektroforetickém přístroji Agilent HP3D CE. Separace byly prováděny v laboratorně sestavené kapiláře vytvořené spojením 9,7 cm dlouhé analytické kapiláry s vnitřním průměrem (d) 25 m a 22,9 cm dlouhé pomocné kapiláry s d 100 m. Vlastní elektroforetická separace probíhá na krátké separační dráze o délce 8,3 cm při současné aplikaci elektrického separačního pole o vysoké intenzitě cca 2,3 kV.cm-1 (při většině elektroforetických separací nepřekračuje intenzita hodnotu 1,0 kV.cm-1 ). Spojená kapilára byla testována při praktických klinických stanoveních: i) stanovení kreatininu v lidské moči prováděné v základním elektrolytu - o složení 20 mM kyselina citronová / NaOH, pH 3,0; ii) stanovení kyseliny močové v lidské moči v základním elektrolytu, 20 mM MES / NaOH, pH 6,0. Za těchto experimentálních podmínek bylo dosaženo velmi krátkých migračních časů, 12,2 s pro kreatinin a 8,6 s pro...
|
|
|
Peptidové inhibitory imobilizované na magnetické nosiče a Sepharosu aplikované na separaci žaludečních aspartátových proteinas
Rajčanová, Michaela ; Kučerová, Zdenka (vedoucí práce) ; Fusek, Martin (oponent) ; Pacáková, Věra (oponent)
v češtině Lidská žaludeční šťáva obsahuje hlavně aspartátové proteinasy: pepsin A a pepsin C. Oba pepsiny jsou produkovány v žaludeční sliznici jako inaktivní pepsinogeny a k jejich aktivaci na příslušné pepsiny dochází v kyselém prostředí žaludku. Hladiny pepsinogenů v krevním séru odrážejí morfologický a funkční stav žaludeční sliznice. Téma dizertační práce je součástí projektu zabývajícího se zejména vypracováním metody pro separaci žaludečních aspartátových proteinas, která by byla vhodná pro diagnostické účely. Konkrétním předmětem předkládané práce byla příprava nových typů ligandů, která by umožňovala po imobilizaci separaci aspartátových proteinas. Pro studium vazebných vlastností pepsinů byly syntetizovány čtyři heptapeptidy obsahující D-leucinylový zbytek (Val-D-Leu-Pro-Phe-Phe-Val-D-Leu, Val-D-Leu-Pro-Tyr-Phe-Val-D-Leu, Val-D-Leu-Pro-Tyr- Tyr-Val-D-Leu a Val-D-Leu-Pro-Phe-Tyr-Val-D-Leu). Připravené heptapeptidy imobilizované na agarosové magnetické částice byly použity pro studium jejich interakcí s prasečím pepsinem A a potkaním pepsinem C. Zatímco prasečí pepsin A byl adsorbován na všechny heptapeptidy imobilizované na magnetické částice, potkaní pepsin C se na imobilizované heptapeptidy neadsorboval. Obdobné výsledky byly získány při afinitní chromatografii na heptapeptidech...
|
host ::
RSS.