|
|
Struktura a funkce glutamátkarboxypeptidasy II
Šácha, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Šedo, Aleksi (oponent) ; Blahoš, Jaroslav (oponent)
4 Závěr GCPII je důležitý protein, který hraje roli v mnoha fyziologických i patologických procesech. Proto bylo třeba získat větší množství enzymaticky aktivního proteinu pro jeho další biochemický výzkum. Heterologní expresí v hmyzích buňkách S2 bylo exprimováno a následně purifikováno dostatečné množství velmi čistého a aktivního enzymu. To umožnilo jeho biochemickou charakterizaci, krystalizaci a později vedlo i k vyřešení krystalové struktury. GCPII je aktivní v širokém rozmezí pH 6 - 8, s maximem kolem pH 7,5. Zjistili jsme, že kromě přirozeného substrátu Ac-Asp-Glu GCPII štěpí také acetylované dipeptidy Ac-Asp-Met, Ac-Glu-Met, Ac-Glu-Glu, Ac-Ala-Glu a Ac-Ala-Met. U těchto substrátů byly změřeny kinetické parametry štěpení. Nalezení dalších substrátů může vést k objevení dosud nepopsaných fyziologických rolí GCPII. Také byly porovnány hodnoty IC50 inhibitorů známých z literatury u námi připravené GCPII a GCPII izolované z potkaních mozků. IC50 bylo u všech méně specifických inhibitorů nižší u rekombinantní GCPII než u GCPII izolované z mozků. Rozdíly ve výsledcích vysvětlujeme vazbou méně specifických inhibitorů na jiné proteiny preparátů z mozku. Vůbec nepochybujeme o tom, že data získaná za použití čistého rekombinantního proteinu jsou přesnější než ta, ktará byla získána ze špatně definovaných...
|
|
|
Mitochondriální beta-laktamasa a její role v lidském organismu
Baudyšová, Alžběta ; Šácha, Pavel (vedoucí práce) ; Pecina, Petr (oponent)
Nádorová onemocnění jsou v současné době jednou z hlavních příčin úmrtí. Lidské tělo má řadu ochranných mechanismů bránících vzniku nádorů. Jedním z těchto mechanismů jsou tumor supresorové geny. Jedním z nedávno popsaných tumor supresorových genů je gen kódující protein LACTB. LACTB je savčím homologem bakteriálních beta-laktamas a proteinů vázajících penicilin (PBPs). PBPs se podílejí na tvorbě bakteriální buněčné stěny, konkrétně na syntéze peptidoglykanu a mohou být inhibovány penicilinovými antibiotiky. Beta-laktamasy jsou enzymy schopné štěpit beta-laktamový kruh penicilinu a rušit tak účinek antibiotik. Hlavním tématem této práce je protein LACTB. LACTB se nachází v mezimembránovém prostoru savčích mitochondrií, kde tvoří filamenta, jejichž funkce není zatím známá. LACTB byl kromě souvislosti s nádorovými onemocněními také asociován s obezitou a alergií na penicilin. V této práci je kladena pozornost především na shromáždění již známých informací o proteinu LACTB a jejich uvedení do širších souvislostí.
|
|
|
Možnosti využití oblačných produktů družicových dat
Šácha, Petr
Název práce: Možnosti využití oblačných produktů družicových dat Autor: Bc. Petr Šácha Katedra: Katedra meteorologie a ochrany prostředí Vedoucí diplomové práce: RNDr. Petr Pišoft Ph.D. e-mail vedoucího: Petr.Pisoft@mff.cuni.cz Abstrakt: Oblačnost hraje zásadní roli v globální energetickém a hydrologickém cyklu. Konkrétně přítomnost oblaků dominuje planetárnímu albedu a účastní se mnoha klimatických zpětných vazeb. V této práci je nejprve podán krátký informativní přehled distančního pozorování, základních informací o organizaci EUMETSAT, jí využívaných družic a její části CM-SAF a rešerše současného výzkumu. Poté je pozornost zaměřena na oblačné produkty získané z družicových dat, speciálně na CFC (procentuelní zakrytí oblačností) a CTY (typ oblačnosti) produkty. Množiny dat denních průměrů těchto produktů jsou porovnávány s denními průměry množství a typu oblačnosti vytvořenými ze staničních SYNOP měření na území České republiky. V případě velkých odchylek mezi zkoumanými datovými soubory denních průměrů pokrytí oblačností jsou hledány možné příčiny jako výběrová chyba, závislost na ročním období, na umístění stanice a na typu a výšce oblačnosti. Je vypočteno mnoho statistických analýz a validačních kritérií. Nakonec jsou diskutovány možnosti využití zkoumaných družicových produktů. Klíčová slova:...
|
|
|
Optimalizace kultivačního média HEK293 buněčné linie
Čuperková, Romana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
HEK293 je lidská buněčná linie odvozená z embryonálních buněk ledvin a je často využívaným systémem pro výrobu rekombinantních proteinů. Tato práce se zabývala optimalizací složení bezsérového média pro HEK293S a HEK293T linie za účelem náhrady drahých komerčních médií. Indikátorem byl růst kultury a exprese reportérových proteinů SEAP a GFP. Podařilo se mi vytvořit nové médium, které mimo jiné obsahovalo insulin (1 mg/l), transferin (5 mg/l) a směs stopových prvků. Při kultivaci ve směsi komerčního média EX-CELL 293 s mým novým médiem se buňky linie 293S množily rychleji než v komerčních médiích (doba zdvojení 20,47 ± 2,68 hodin (srel = 13,1 %)). Zdá se, že je nové médium vhodné také pro transfekci HEK293 linií a poskytuje relativně vysokou expresi rekombinantních proteinů. Transfekční poměr DNA:PEI (w/w) pro toto médium je 1:2 až 1:3.
|
|
|
Možnosti využití oblačných produktů družicových dat
Šácha, Petr ; Pišoft, Petr (vedoucí práce) ; Mikšovský, Jiří (oponent)
Název práce: Možnosti využití oblačných produktů družicových dat Autor: Bc. Petr Šácha Katedra: Katedra meteorologie a ochrany prostředí Vedoucí diplomové práce: RNDr. Petr Pišoft Ph.D. e-mail vedoucího: Petr.Pisoft@mff.cuni.cz Abstrakt: Oblačnost hraje zásadní roli v globální energetickém a hydrologickém cyklu. Konkrétně přítomnost oblaků dominuje planetárnímu albedu a účastní se mnoha klimatických zpětných vazeb. V této práci je nejprve podán krátký informativní přehled distančního pozorování, základních informací o organizaci EUMETSAT, jí využívaných družic a její části CM-SAF a rešerše současného výzkumu. Poté je pozornost zaměřena na oblačné produkty získané z družicových dat, speciálně na CFC (procentuelní zakrytí oblačností) a CTY (typ oblačnosti) produkty. Množiny dat denních průměrů těchto produktů jsou porovnávány s denními průměry množství a typu oblačnosti vytvořenými ze staničních SYNOP měření na území České republiky. V případě velkých odchylek mezi zkoumanými datovými soubory denních průměrů pokrytí oblačností jsou hledány možné příčiny jako výběrová chyba, závislost na ročním období, na umístění stanice a na typu a výšce oblačnosti. Je vypočteno mnoho statistických analýz a validačních kritérií. Nakonec jsou diskutovány možnosti využití zkoumaných družicových produktů. Klíčová slova:...
|
|
|
Příprava expresního systému gama-laktamázy a otestování exprese v E.coli
Magyerková, Monika ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
γ-laktamasa je enzym štěpící pětičlenné laktamové cykly. Jedním z jejích potenciálních substrátů je polyvinylpyrrolidon (PVP). Degradace PVP γ-laktamasou je zkoumána s ohledem na využití v čistírnách odpadních vod. Cílem této práce proto bylo připravit synteticky gen γ- laktamasy z bakterie Comamonas acidovorans a provést jeho klonování do expresního vektoru pET22b. Pro syntézu genu γ-laktamasy byla použita metoda PCA. Sekvence genu γ- laktamasy o délce 1725 bp byla rozdělena do dvou částí (syntonů), které byly syntetizovány samostatně. Po syntéze bylo provedno restrikční štěpení a ligace do vektoru pUC19. Takto připravenými konstrukty byly transformovány kompetentní buňky E. coli kmene DH5α. Po ověření správnosti sekvencí byly oba syntony vyštěpeny restrikčními endonukleasami a spojeny jednokrokovou ligací do plazmidu pET22b. Rekombinantním plazmidem obsahujícím spojené syntony byly transformovány expresní buňky E. coli kmene BL21(DE3)RIL a byla testována exprese rekombinantní γ-laktamasy. Sekvence klonu produkujícío protein odpovídající délky byla potvrzena sekvenční analýzou. Připravený expresní plazmid bude použit pro produkci rekombinantní γ-laktamasy. (In Czech)
|
|
| |
|
|
Nefropatie a nádorová onemocnění způsobené alkaloidy aristolochovými kyselinami
Bárta, František ; Šácha, Pavel (oponent) ; Stiborová, Marie (vedoucí práce)
Aristolochové kyseliny (AA) jsou látky obsažené v rostlinách čeledi podražcovitých (Aristolochiaceae). Tyto rostliny jsou již od starověku používány v tradiční lidové medicíně k léčení mnoha rozličných chorob. Jsou sice známy protizánětlivé účinky aristolochových kyselin, nicméně tyto alkaloidy jsou prokazatelnými mutageny a karcinogeny. Navzdory tomuto faktu jsou výtažky rostlin čeledi podražcovitých nadále užívány v léčitelství. Aristolochové kyseliny prokazatelně způsobují onemocnění nazývané nefropatie vyvolaná aristolochovými kyselinami (Aristolochic Acid Nephropathy, AAN), dříve známou jako nefropatie vyvovolaná čínskými bylinami (Chinese Herbs Nephropathy, CHN), která končí úplným selháním funkce ledvin. Pozdní komplikací tohoto onemocnění je také vývoj nádorů v urotheliální tkáni pacientů. AA totiž mohou vytvářet s DNA stabilní kovalentní adukty, které se vyznačují dlouhodobou persistencí. Tvorba těchto aduktů následně vede ke vzniku unikátní mutace v tumorovém supresorovém genu p53 (AT→TA transversní mutace) iniciující nádorové procesy. I další onemocnění, balkánská endemická nefropatie (BEN), je spojována s působením AA. V tomto případě ovšem je brán v potaz i vliv ostatních činitelů, např. mykotoxinů (ochratoxin A). Nicméně, s vysokou pravděpodobností se na vývoji tohoto onemocnění...
|
|
|
Optimalizace rekombinantní exprese proteinů v HEK293 buněčné linii
Bláha, Jan ; Šácha, Pavel (oponent) ; Bezouška, Karel (vedoucí práce)
Savčí buňky jsou dominantním systémem pro rekombinantní expresi farmaceutických proteinů. S rozvojem metodiky transientní transfekce savčích buněk se tento systém stává vhodným také pro strukturní biologii. Tato práce se zabývala optimalizací rekombinantní exprese v buněčných liniích HEK293T a HEK293-6E v různých médiích za použití snadno stanovitelných reportérových proteinů - sekretované alkalické fosfatasy (SEAP) a zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Důraz byl kladen na optimalizaci klíčových faktorů tvorby transfekčního komplexu - poměru DNA a polyethyleniminu a množství vložené DNA. Sledován byl i pozitivní vliv inhibitoru histonových deacetylas kyseliny valproové a dále kaseinového hydrolyzátu Tryptone N1.
|
|
|
New Perspective on the Role of Gravity Waves in the Stratospheric Dynamics and Variability
Šácha, Petr ; Pišoft, Petr (vedoucí práce) ; Dameris, Martin (oponent) ; Rieder, Harald (oponent)
This thesis is concerned with the role of internal gravity waves (IGWs) in the stratospheric dynamics and variability demonstrating the effect of spatiotemporal distribution of their activity on the stratospheric dynamics and transport. The first part introduces a theoretical overview of the most recent as well as classical approaches used for description of the wave-mean interaction in the middle atmosphere. Methodology for an IGW analysis from the GPS radio occultation density data is described in the next chapter and the advantages of utilization of density data are listed. The third chapter presents results describing the peculiar dynamics and anomalous IGW activity in the Eastern Asia/Northern Pacific region. An important part is dedicated to a discussion of accuracy limits and usability of different IGW activity proxies. The possible impact of the localized IGW activity is investigated using a mechanistic middle and upper atmosphere model in the last chapter. Sensitivity simulations are used to demonstrate an important role of the spatial distribution of IGW activity for a formation of planetary waves and for the longitudinal variability of the Brewer-Dobson circulation. Implications for the middle atmospheric and climate change research are discussed along with consequences for parameterizations of...
|
host ::
RSS.