|
|
Chromatografické metody pro stanovení metabolitů značených stabilními izotopy a jejich aplikace v klinickém výzkumu
ŽABOKRTSKÁ, Jana
V lékařské diagnostice jsou využívány látky značené radioaktivními nebo stabilními izotopy. V současné době se nejčastěji užívají substráty značené stabilními izotopy 13C nebo 2H k hodnocení metabolismu v patologických situacích. Moderní přístupem je kombinace mikrodialyzační metody a aplikace stabilních izotopů. V této práci jsou popsány analytické metody pro stanovení glukosy a laktátu v mikrodialyzátu. Vzhledem k užití látek, značených stabilními izotopy, byly tyto látky stanovovány metodou plynové chromatografie s detekcí hmotnostním spektrometrem (GC-MS). Cílem práce byl vývoj, stanovení parametrů, validace a optimalizace analytických metod se zaměřením na měření izotopového obohacení molekul vybraných analytů. Izotopové obohacení glukosy bylo stanovováno po její derivatizaci hydroxylamin hydrochloridem a acetanhydridem. Byl stanovován derivát aldonitril pentacetyl-D-glukosa. V práci popsaná metoda je výsledkem optimalizace času a teploty derivatizace vzorků mikrodialyzátů a chromatografických podmínek. Získaná data byla vyhodnocena softwarem Chemstation a statistickým softwarem SigmaStat. Správnost byla ověřena metodou standardního přídavku a byla stanovena 1,48%, přesnost byla stanovena opakovaným měřením reálného vzorku - variační koeficient byl 2,51%. Parametry lineární regrese pro koncentrace 0,5 {--} 15 mmol/l byly za daných podmínek s regresním koeficientem (R2) 0,9997 a rovnice regrese y = -0,0185 + 0,142x. Běžně je glukosa pro stanovení plynovou chromatografii derivatizována pouze acetanhydridem, který však při použití kapilární kolony CP-Sil 8 CB-MS (60 m x 0,32 mm) poskytuje interferenci v chromatografickém záznamu - dvojitý pík pravděpodobně vzniklých izomerů pentacetyl-glukosy, proto bylo nutno derivatizovat aldehydickou skupinu glukosy nejprve hydroxylamin hydrochloridem. Výsledná metoda vykazuje vhodné parametry pro užití v analýze mikrodialyzačních vzorků. Laktát byl stanovován derivatizací dimethoxypropanem, propylaminem a dále heptafluorobutyranhydridem za vzniku derivátu L-lactin-n-propylamidheptafluorobutyrátu. Byly stanoveny tyto parametry {--} správnost 3,25%, přesnost 3,15%, parametry lineární regrese pro koncentrace v rozmezí 0,5 {--} 10 mmol/l byly za daných podmínek R2 = 0,999 a rovnice regrese y = 0,215 + 1,039x. Tato poměrně složitá derivatizační metoda byla převzata ze spolupracujícího pracoviště na Univerzitě v Lausanne a její parametry byly porovnávány s jednodušší metodou derivatizace pomocí N-(butyl-dimethyl-silyl)-2,2,2-trifluoro-N-methyl-acetamidem. Vzniklý derivát di(tert-butyldimethylsilyl) laktátu byl stanovován metodou GC-MS. Přesnost byla 3,02%, správnost 3,8%, parametry lineární regrese R2 = 0,999, regresní rovnice y = -0,0809 + 0,792x. Prezentované metody byly využity v pilotní studii mikrodialýzy svalu a jater potkanů v různých metabolických situacích. V součastné době jsou metody využívány v klinické studii na pacientech trpících diabetem mellitem 1. typu a rozšířily spektrum metod prováděných laboratoří Kliniky gerontologické a metabolické FNHK.
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Influence of the laser power and analyte concentration on the results in MALDI-TOF MS of oligosaccharides
Čáslavský, Josef ; Chmelík, Josef
MALDI-TOF MS has been successfully applied for the analysis of a wide range of organic biopolymers including oligosaccharides. We focus our attention to the group of oligosaccharides occuring in beer and in malting and mashing products, which are mainly oligosaccharides containing from 3 to more than 30 glucose units in their molecules. We tried to evaluate various factors influencing the obtained results. We found that the shape of the spectrum depends significantly on the energy of ionising laser pulse and also on the amount of the analyte on the MALDI target. These effects were studied with standard mixtures as well as with real samples.
|
host ::
RSS.