|
|
Analýza glykoproteinů ze slinných žláz klíštěte \kur{Ixodes ricinus}
BUČINSKÁ, Lenka
Charakterizovala jsem nekolik potencionálních glykoproteinů z extraktů slinných žláz nenasátých a částečně nasátých samic klíštěte Ixodes ricinus použitím afinitního značení s lektiny a pomocí enzymatické deglykosylační reakce. Izolovala jsem glykoprotein specifický k lektinu GNA. Tento glykoprotein obsahuje N{--}vázanou terminální manózu připojenou Man{$\alpha$}1,3Man. Tento protein byl hmotnostní spektrometrii určen jako Karboxypeptidáza M. Dále byly izolovány dva glykoproteiny obsahující GalNAc pomocí HPA{--}afinitní chromatografie. Výsledkem MS analýzy bylo určení morčecího proteinu Trappin 12. V SŽ nasáté samice klíštěte jsem detekovala fukózu vazanou vazbami {$\alpha$}1,2, {$\alpha$}1,3 a {$\alpha$}1,6. Také přítomnost O{--}vázané fukózy je možná. Přítomnost kyseliny sialové v glykoproteinech SŽ a slinách nasáté samice klíště byla nepřímo prokázána vazbou s MAA II lektinem. Analýzou hmotnostní spekrometrie byla zjištěna N{--}terminální sekvence peptidu podobná s myším sialoadhesinem (Siglec 1). Dosavadní výsledky z MS zatím nepřispěly k potvrzení či vyvrácení přítomnosti Siglec 1. Z nenasátých SŽ samic jsme izolovali dva proteiny specifické pro značení GNA lektinem. Byly předběžně identifikovány jako protein podobný arylsulfatáze B a Sojo protein cytoskeletu klíštěte Ixodes. Přítomnost proteinů s GNA specifitou byla prokázána v granulech acinů SŽ nenasáté a částečně nasáté samice klíštěte. Přítomnost fukózy byla prokázána v granulárních buňkách acinů II a III a ve střevních buňkách a obsahu střeva klíštěte pomocí afinitního značení a reakce byla pozorována florescenčním mikroskopem.
|
|
| |
|
|
Chromatografické metody pro stanovení metabolitů značených stabilními izotopy a jejich aplikace v klinickém výzkumu
ŽABOKRTSKÁ, Jana
V lékařské diagnostice jsou využívány látky značené radioaktivními nebo stabilními izotopy. V současné době se nejčastěji užívají substráty značené stabilními izotopy 13C nebo 2H k hodnocení metabolismu v patologických situacích. Moderní přístupem je kombinace mikrodialyzační metody a aplikace stabilních izotopů. V této práci jsou popsány analytické metody pro stanovení glukosy a laktátu v mikrodialyzátu. Vzhledem k užití látek, značených stabilními izotopy, byly tyto látky stanovovány metodou plynové chromatografie s detekcí hmotnostním spektrometrem (GC-MS). Cílem práce byl vývoj, stanovení parametrů, validace a optimalizace analytických metod se zaměřením na měření izotopového obohacení molekul vybraných analytů. Izotopové obohacení glukosy bylo stanovováno po její derivatizaci hydroxylamin hydrochloridem a acetanhydridem. Byl stanovován derivát aldonitril pentacetyl-D-glukosa. V práci popsaná metoda je výsledkem optimalizace času a teploty derivatizace vzorků mikrodialyzátů a chromatografických podmínek. Získaná data byla vyhodnocena softwarem Chemstation a statistickým softwarem SigmaStat. Správnost byla ověřena metodou standardního přídavku a byla stanovena 1,48%, přesnost byla stanovena opakovaným měřením reálného vzorku - variační koeficient byl 2,51%. Parametry lineární regrese pro koncentrace 0,5 {--} 15 mmol/l byly za daných podmínek s regresním koeficientem (R2) 0,9997 a rovnice regrese y = -0,0185 + 0,142x. Běžně je glukosa pro stanovení plynovou chromatografii derivatizována pouze acetanhydridem, který však při použití kapilární kolony CP-Sil 8 CB-MS (60 m x 0,32 mm) poskytuje interferenci v chromatografickém záznamu - dvojitý pík pravděpodobně vzniklých izomerů pentacetyl-glukosy, proto bylo nutno derivatizovat aldehydickou skupinu glukosy nejprve hydroxylamin hydrochloridem. Výsledná metoda vykazuje vhodné parametry pro užití v analýze mikrodialyzačních vzorků. Laktát byl stanovován derivatizací dimethoxypropanem, propylaminem a dále heptafluorobutyranhydridem za vzniku derivátu L-lactin-n-propylamidheptafluorobutyrátu. Byly stanoveny tyto parametry {--} správnost 3,25%, přesnost 3,15%, parametry lineární regrese pro koncentrace v rozmezí 0,5 {--} 10 mmol/l byly za daných podmínek R2 = 0,999 a rovnice regrese y = 0,215 + 1,039x. Tato poměrně složitá derivatizační metoda byla převzata ze spolupracujícího pracoviště na Univerzitě v Lausanne a její parametry byly porovnávány s jednodušší metodou derivatizace pomocí N-(butyl-dimethyl-silyl)-2,2,2-trifluoro-N-methyl-acetamidem. Vzniklý derivát di(tert-butyldimethylsilyl) laktátu byl stanovován metodou GC-MS. Přesnost byla 3,02%, správnost 3,8%, parametry lineární regrese R2 = 0,999, regresní rovnice y = -0,0809 + 0,792x. Prezentované metody byly využity v pilotní studii mikrodialýzy svalu a jater potkanů v různých metabolických situacích. V součastné době jsou metody využívány v klinické studii na pacientech trpících diabetem mellitem 1. typu a rozšířily spektrum metod prováděných laboratoří Kliniky gerontologické a metabolické FNHK.
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
host ::
RSS.