|
|
Transkripční faktory CSL a jejich role v kvasince Schizosaccharomyces pombe
Oravcová, Martina ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Proteiny rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/LAG-1) působí v organismech říše Metazoa jako efektory signální dráhy Notch. V rámci této signalizace fungují jako represory nebo aktivátory transkripce genů a ovlivňují mnoho vývojových procesů. Metazoální proteiny CSL mohou regulovat expresi genů také nezávisle na Notch. Funkce proteinů CSL nezávislé na Notch by mohly být evolučně původní a pro buňku a organismus mohou být neméně důležité jako funkce dependentní na Notch. Přítomnost proteinů CSL byla zjištěna i u některých organismů říše Fungi, které postrádají komponenty signální dráhy Notch a většinu známých metazoálních interakčních partnerů proteinů CSL. Paralogy CSL poltivé kvasinky Schizosaccharomyces pombe, cbf11 a cbf12, jsou neesenciální geny kódující proteiny lokalizované v jádře buňky. Oba se antagonistickým způsobem zapojují do regulace procesů jako například koordinace jaderného a buněčného dělení a průchodu buněčným cyklem, udržování ploidie, adhezivity buněk a dalších. V této práci jsme prokázali, že oba paralogy CSL mají schopnost sekvenčně specificky vázat kanonický CSL-responzivní element DNA in vitro a Cbf11 také in vivo. Oba proteiny mohou aktivovat genovou expresi in vivo, a vykonávat tak funkci transkripčních faktorů. Pomocí metody ChIP-chip jsme analyzovali vazbu...
|
|
|
Transkripční faktory řídící periodickou genovou expresi v buněčném cyklu Schizosaccharomyces pombe
Jordáková, Anna ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Paleček, Jan (oponent)
Poltivá kvasinka Schizosaccharomyces pombe hraje důležitou úlohu při objasňování mechanismů regulace buněčného cyklu a při charakterizaci příslušných efektorových molekul. Buněčný cyklus S. pombe sestává z dlouhé růstové G2 fáze, která je následována jaderným dělením (M fáze), velmi krátkou G1 fází a replikací DNA (S fáze). Již během S fáze dochází k tvorbě buněčné přepážky. Postup fázemi buněčného cyklu je regulován na mnoha úrovních. Ačkoli je kvasinka S. pombe velmi studovaný modelový organismus, znalost transkripční sítě regulující průchod buněčným cyklem je zatím neúplná. Transkripční faktory jsou velmi důležité regulátory genové exprese, a proto je jejich charakterizace předmětem výzkumu. Doposud bylo identifikováno jen několik transkripčních faktorů, které v průběhu buněčného cyklu regulují oscilující a vzájemně na sobě závislé vlny genové exprese. Tato práce shrnuje současný stav poznání na poli transkripční regulace periodické genové exprese v buněčném cyklu S. pombe.
|
|
|
Optimalizace expresního systému HEK293 buněčné linie pomocí regulace buněčného cyklu a apoptózy
Poláchová, Edita ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Tranzientní transfekce savčích buněčných linií je známa jako užitečná technika pro přípravu rekombinantních proteinů, kterou lze získat miligramy až gramy proteinů za pouhé dva týdny od klonování odpovídající cDNA. Takto připravené nativní glykosylované proteiny mohou být využity pro různé účely v molekulární biologii, imunologii či farmaceutickém průmyslu, např. pro počáteční fáze preklinického výzkumu terapeutických proteinů. Jednou z nejvíce používaných hostitelských savčích buněčných linií je v tomto ohledu linie lidských embryonálních ledvinných buněk, kterou lze dobře kultivovat a snadno se chemicky transfekuje. Produkce proteinů v tranzientně transfekovaných lidských embryonálních ledvinných buňkách může být zvýšena celou řadou faktorů, např. koexpresí kyselého růstového faktoru fibroblastu či jeho přídavkem do kultivačního média, anebo koexpresí proteinů regulujících buněčný cyklus či apoptózu. Byl připraven expresní plazmid pTW5, do kterého byl následně vložen gen pro aFGF, regulátor buněčného cyklu p18, p21 či p27 (inhibitory cyklin-dependentních kináz) nebo inhibitor apoptózy bcl-2 či bcl-x. Tyto plazmidy byly využity k optimalizaci expresního systému buněčné linie HEK293T. Za pomoci modelových proteinů - zeleného fluorescenčního proteinu a sekretované alkalické fosfatázy - byl sledován...
|
|
|
Transkripční faktory CSL a jejich role v kvasince Schizosaccharomyces pombe
Oravcová, Martina
Proteiny rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/LAG-1) působí v organismech říše Metazoa jako efektory signální dráhy Notch. V rámci této signalizace fungují jako represory nebo aktivátory transkripce genů a ovlivňují mnoho vývojových procesů. Metazoální proteiny CSL mohou regulovat expresi genů také nezávisle na Notch. Funkce proteinů CSL nezávislé na Notch by mohly být evolučně původní a pro buňku a organismus mohou být neméně důležité jako funkce dependentní na Notch. Přítomnost proteinů CSL byla zjištěna i u některých organismů říše Fungi, které postrádají komponenty signální dráhy Notch a většinu známých metazoálních interakčních partnerů proteinů CSL. Paralogy CSL poltivé kvasinky Schizosaccharomyces pombe, cbf11 a cbf12, jsou neesenciální geny kódující proteiny lokalizované v jádře buňky. Oba se antagonistickým způsobem zapojují do regulace procesů jako například koordinace jaderného a buněčného dělení a průchodu buněčným cyklem, udržování ploidie, adhezivity buněk a dalších. V této práci jsme prokázali, že oba paralogy CSL mají schopnost sekvenčně specificky vázat kanonický CSL-responzivní element DNA in vitro a Cbf11 také in vivo. Oba proteiny mohou aktivovat genovou expresi in vivo, a vykonávat tak funkci transkripčních faktorů. Pomocí metody ChIP-chip jsme analyzovali vazbu...
|
|
|
The role of Ser/Thr phosphorylation of p130CAS in signaling
Dibus, Michal ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Macůrková, Marie (oponent)
p130Cas je dôležitý adaptorový proteín, zohrávajúci kľúčovú úlohu v mnohých bunkových signálnych procesoch. Keďže p130Cas je známym substrátom pre široké spektrum kináz, jeho funkcia je regulovaná predovšetkým zmenami vo fosforylácii na tyrozínových, treonínových a serínových zvyškoch. Táto práca sa zameriava na serín/treonínovú fosforyláciu p130Cas a jej úlohu v regulácii signalizácie. Napriek známej regulácii serín/treonínovej fosforylácie p130Cas v priebehu bunkového cyklu, bunkovej adhézie sprostredkovanej integrínmi a asociáciou s BCAR3, mechanizmy sprostredkujúce túto fosforyláciu dodnes nie sú úplne objasnené a kinázy hrajúce úlohu v týchto procesoch sú doposiaľ neznáme. Keďže p130Cas je dôležitým regulátorom bunkovej migrácie a nádorovej invazivity, pochopenie týchto mechanizmov by mohlo byť prínosné pre vývoj nových stratégii v cielení protinádorových liečiv.
|
|
|
Význam Chk2 kinázy ve vnitrobuněčné signalizaci a důsledky jejích poruch v onkogenezi
Stolařová, Lenka ; Kleibl, Zdeněk (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent)
Kináza Chk2 (checkpoint kinase 2), ovlivňující kontrolní body buněčného cyklu, je kódována genem CHEK2. Patří mezi serin/threoninové kinázy a její dominantní aktivitou je regulace a intracelulární distribuce signálu v odpovědi na přítomnost poškození genomové DNA. Aktivátorem Chk2 je kináza ATM fosforylující Thr68 v oblasti FHA domény Chk2. Vyvolaná sterická změna indukuje homodimerizaci Chk2 a aktivační fosforylaci v oblasti kinázové domény. Následně disociující katalyticky aktivní protomery Chk2 a fosforylují intracelulární proteiny (p53, E2F-1, BRCA1, Cdc25A a C, BRCA2 a PLK3), čímž se Chk2 podílí na zástavě buněčného cyklu, regulaci reparace DNA a apoptózy. Vrozené mutace v genu CHEK2 byly nalezeny v souvislosti se zvýšeným výskytem řady nádorových onemocnění, včetně karcinomu prsu a kolorekta a ztráta funkce Chk2 se tak podílí na procesu nádorové transformace.
|
|
|
Vztah mezi genetickými polymorfismy DNA reparačních genů a jejich expresí u zdravé populace (s výhledem na stanovení u onkologických pacientů).
Hánová, Monika ; Vodička, Pavel (vedoucí práce) ; Bencko, Vladimír (oponent) ; Černá, Marie (oponent)
Odpověď na poškození DNA je komplexní systém, odpovědný za ochranu buňky proti vnitřním a vnějším vlivům poškozujícím DNA a za udržování integrity genomu. Mnoho genů, které se účastní signálních drah reagujících na poškození DNA, je polymorfních. Genetické polymorfismy v kódujících a regulačních oblastech mohou mít vliv na funkci proteinů, které tyto geny kódují. Fenotypový efekt jednonukleotidových polymorfismů (SNPs), je předmětem zkoumání v souvislosti se schopností buňky zvládat genotoxický stres a následně ve vztahu k riziku vzniku onkologického onemocnění. Cílem této práce bylo zhodnotit vztah mezi SNPs v genech zodpovědných za opravy poškození DNA (hOGG1, XRCC1, XPC) a genech buněčného cyklu (TP53, p21CDKN1A , BCL2 a BAX) a expresí na úrovni mRNA v lymfocytech periferní krve u subjektů exponovaných styrenu v pracovním prostředí a u kontrolních subjektů. Cíl byl rozšířen na analýzu vztahu mezi expresí uvedených genů na úrovni mRNA a markery expozice styrenu (koncentrace styrenu v krvi a ve vzduchu), markery poškození DNA (jednořetězcové zlomy - SSBs; místa specifická pro endonukleázu III - Endo III místa) a kapacitou bázové excizní opravy (BER) měřené pomocí míry opravy poškození DNA způsobeného γ-zářením a schopností opravovat oxidativní poškození. Studie na skupině zdravých jedinců...
|
|
|
Kinázová signalizace v meióze I savčích oocytů
Brzáková, Adéla ; Šolc, Petr (vedoucí práce) ; Dráber, Pavel (oponent)
Polo-like kináza 1 (PLK1) patří do rodiny serin-threonin kináz řídících buněčný cyklus, podílí se na kontrole mitózy a přispívá rovněž k regulaci meiotického dělení. S použitím akutní farmakologické inhibice a metody Live Cell Imaging (LCI) se nám podařilo charakterizovat roli PLK1 v meióze I myších oocytů. Jaderná membrána oocytů s inhibovanou PLK1 se začíná rozpadat výrazně později než jaderná membrána kontrolních oocytů. Po inhibice PLK1 je také opožděno zahájení kondenzace chromatinu. Zároveň se, na rozdíl od kontrolních oocytů, jaderná membrána po inhibice PLK1 nezačíná rozpadat společně se zahájením kondenzace chromatinu - v oocytech s inhibovanou PLK1 se jaderná membrána rozpadá až ve chvíli, kdy je chromatin téměř úplně zkondenzován. Také trvání rozpadu jaderné membrány a kondenzace chromatinu je inhibicí PLK1 prodlouženo. Je známo, že v somatických buňkách zabraňuje inhibice PLK1 výstavbě dělícího vřeténka se dvěma póly. V myších oocytech to ale neplatí, tam se i po inhibici PLK1 bipolární dělící vřeténko vytváří, ačkoli jeho výsledný objem je menší než u kontrolních oocytů. I přes to, že jsou myší oocyty i po inhibici PLK1 schopny sestavit bipolární dělící vřeténko, zůstávají zastaveny před zahájením anafáze a nedochází u nich k segregaci chromosomů. Také somatické buňky s inhibovanou PLK1...
|
|
|
Modelování dynamiky buněčných kolonií
Bělehrádek, Stanislav ; Škutková, Helena (oponent) ; Sedlář, Karel (vedoucí práce)
Obsahem diplomové práce je popis intracelulárních procesů zodpovědných za řízení buněčného cyklu a reakce buněk na vnější i vnitřní podněty. Popsány jsou důležité signální dráhy a metody, kterými je lze simulovat in silico. Z popsaných buněčných dějů je vytvořen model buněčného cyklu, který je implementován do nástroje naprogramovaném v C++ s využitím OpenGL pro vizualizaci. Model je otestován pro různé buněčné procesy a pro růst buněk HeLa. Výsledky jsou nakonec porovnány s chováním živých buněk.
|
|
|
Dynamics of selected DNA damage response proteins
Benada, Jan ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Kuthan, Martin (oponent)
Buněčná odpověd' na poškození DNA (DNA damage response) představuje kriti- cky důležitou signalizační sít', která ochraňuje celistvost genomu a brání vzniku rakoviny. Studium odpovědi na poškození DNA má tudíž zásadní klinický výz- nam a proteiny účastnící se této signalizace jsou slibnými cíli léčiv. Ačkoliv byly dosaženy značné pokroky v popisu interakcí jednotlivých proteinů této signali- zace, stále potřebujeme lépe porozumět komplexnímu chování celé signální sítě. Jedním z přístupů, který nám v tomto může pomoci, je popsání dynamiky klíčo- vých proteinů této signalizace v různých podmínkách. Prvním cílem této práce bylo popsat časovou dynamiku vybraných proteinů odpovědi na poškození DNA po různých genotoxických insultech, konkrétně po γ-ozáření a UV-C ozáření. Uká- zali jsme, že zatímco určité proteiny jsou aktivovány v jednom spojitém pulzu, jiné vykazují aktivaci v sérii pulzů. Na buněčné linii MCF7 jsme po γ-ozáření pozorovali již dříve popsané pulzy p53. Nicméně, na buněčné linii U2OS jsme po γ-ozáření detekovali spojitý nárůst hladin p53. Stejnou dynamiku p53 jsme pozorovali i po UV-C ozáření. Navrhujeme, že dynamika p53 závisí na účin- ném zapojení negativní zpětné vazby mezi kinázami aktivujícími p53 a fosfatázou Wip1. V druhé části této...
|
host ::
RSS.