|
|
Analýza zotavování membránového potenciálu kvasinek za stresových podmínek vyvolaných protonoforem CCCP
Babuka, David ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá studiem odezvy vnitrobuněčného pH kvasinkových buněk na různá vnější prostředí, především ve vztahu k protonoforu karbonylkyanidu m-chlorophenylhydrazonu, CCCP. K měření vnitrobuněčného pH kvasinkových buněk jsme využívali geneticky kódovanou fluorescenční sondu poměrový pHluorin. S využitím metody synchronně skenovaných fluorescenčních spekter jsme byli schopni měřit vnitrobuněčné pH buněk s vysokou přesností. Jako součást těchto experimentů jsme studovali také jak vliv iontové síly pufrů buněčných suspenzí na povrchový potenciál kvasinek, tak vliv anorganické soli KCl na depolarizaci membrán kvasinek a acidifikaci cytosolu vyvolanou protonoforem CCCP. Zkoumali jsme jednak přímo změny cytosolického pH a jednak jsme toto naměřené pH používali jako indikátor procesů a stavu prostředí mimo buňku. K nejvýznamnějším výsledkům této práce patří vyvinutí nové metody monitorování velikosti povrchového potenciálu kvasinek pomocí titračních křivek acidifikace cytosolu vyvolané protonoforem CCCP.
|
|
|
The effect of antimicrobial peptides on Saccharomyces cerevisiae and other yeast species
Makarova, Anna-Marie ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Z důvodu nadměrného užívání antibiotik, antimykotik a dezinfekčních prostředků v posledních desetiletích, byla u patogenních mikroorganismů vyvinuta značná rezistence vůči těmto látkám. Kvasinky rodu Candida představují čtvrtého nejčastějšího původce kvasinkových infekcí u hospitalizovaných pacientů a pro 40% z nich jsou letální. Díky mechanismu účinku rozdílným od zmíněných současně užívaných antimykotik a antibiotik se antimikrobiální peptidy stávají slibnými kandidáty pro vývoj nových léčiv proti kvasinkovým a bakteriálním infekcím. Tato práce se zabývá peptidy izolovanými z divokých včel a jejich syntetickými analogy a identifikuje ty nejefektivnější v boji proti nejčastějším druhům kvasinek Candida a modelové kvasince Saccharomyces cerevisiae. Byl testován a porovnáván antifungální efekt osmi peptidů v různých definovaných podmínkách. Za účelem identifikace případného synergistického působení antimikrobiálních peptidů a současně užívaných antimykotik byla zjišťována citlivost patogenních kvasinek k těmto konvenčním antifungálním látkám, peptidům, a k jejich kombinacím. Odpověď kvasinkových buněk na úrovni plasmatické membrány byla studována měřením relativního membránového potenciálu pomocí fluorescenční sondy (diS-C3(3)). Hyperpolarizační efekt byl pozorován pro každý jednotlivý peptid. Dále...
|
|
|
Mechanizmus účinku a rezistence na daptomycin
Helusová, Michaela ; Mikušová, Gabriela (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Daptomycin patří mezi antimikrobiální peptidy, což jsou látky vyskytující se v obranném systému všech organismů. Molekula daptomycinu se skládá z cyklického peptidu a lipidové části. Daptomycin je produkován bakterií Streptomyces roseosporus a používá se k léčbě infekcí způsobených gram-pozitivními bakteriemi. Je účinný i proti některým multirezistentním kmenům bakterií jako je např. kmen Staphylococcus aureus rezistentní k meticilinu. Jeho antimikrobiální účinek je závislý na přítomnosti vápníku a fosfatidylglycerolu v cílové membráně, ve které tvoří oligomery. Jeho mechanizmus účinku tedy pravděpodobně tkví ve tvorbě pórů, které způsobují narušení membrány. Poškození membrány vede k výtoku iontů z buňky a tím k depolarizaci membránového potenciálu, což v důsledku způsobuje zastavení syntézy makromolekul a smrt buňky. Expozice daptomycinu také způsobuje změnu morfologie buněk. I přes neobvyklý mechanizmus účinku byly na působení daptomycinu vytvořeny různé mechanizmy rezistence u různých patogenních bakterií. Patří mezi ně např. snížení obsahu fosfatidylglycerolu v membráně, zvýšení podílu lysylfosfatidylglycerolu, uvolňování membránových lipidů nebo mutace v genech ovlivňujících syntézu peptidoglykanu.
|
|
|
Analýza zotavování membránového potenciálu kvasinek za stresových podmínek vyvolaných protonoforem CCCP
Babuka, David ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá studiem odezvy vnitrobuněčného pH kvasinkových buněk na různá vnější prostředí, především ve vztahu k protonoforu karbonylkyanidu m-chlorophenylhydrazonu, CCCP. K měření vnitrobuněčného pH kvasinkových buněk jsme využívali geneticky kódovanou fluorescenční sondu poměrový pHluorin. S využitím metody synchronně skenovaných fluorescenčních spekter jsme byli schopni měřit vnitrobuněčné pH buněk s vysokou přesností. Jako součást těchto experimentů jsme studovali také jak vliv iontové síly pufrů buněčných suspenzí na povrchový potenciál kvasinek, tak vliv anorganické soli KCl na depolarizaci membrán kvasinek a acidifikaci cytosolu vyvolanou protonoforem CCCP. Zkoumali jsme jednak přímo změny cytosolického pH a jednak jsme toto naměřené pH používali jako indikátor procesů a stavu prostředí mimo buňku. K nejvýznamnějším výsledkům této práce patří vyvinutí nové metody monitorování velikosti povrchového potenciálu kvasinek pomocí titračních křivek acidifikace cytosolu vyvolané protonoforem CCCP.
|
|
|
Characterization of native and heterologously expressed membrane transporters in yeast using fluorescent probes
Zahumenský, Jakub ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Cebecauer, Marek (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Transportéry plasmatické membrány kvasinekhrají důležitou úlohu v mnoha buněčných dějích. Mezi tyto děje patří například detoxikace a budování a udržování membránového potenciálu (ΔΨ). Metoda využívající fluorescenční sondu diS-C3(3) vyvinuta na Oddělení biofyziky Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy nám umožnila pohodlně studovat obojí a je zároveň vhodným nástrojem pro sledování změn těchto důležitých parametrů. Mnohé studie jak na živočišných buňkách, tak i na kvasinkách, ukázali, že etanol a jiné alkoholy inhibují funkci různých membránových kanálů, receptorů a specifických transportérů. Jako mechanismus účinku byla uvažována přímá interakce alkoholů s těmito membránovými proteiny. V naší studii jsme pro identifikaci inhibitorů pump mnohočetné lékové rezistence použili metodu s fluorescenční sondou diS-C3(3) a sadu kvasinkových kmenů s delecí genů PDR5 a SNQ2. Zjistili jsme, že pumpy kódované těmito dvěma geny jsou inhibovány n-alkoholy (od etanolu po hexanol). Ukázali jsme, že inhibiční účinek roste s délkou uhlovodíkového řetězce alkoholů, nesouvisí s poškozením plasmatické membrány a je plně revezibilní. Tyto zjištění napovídají, že studovaný inhibiční účinek nemusí nutně zahrnovat jenom změny lipidové matrice plasmatické membrány, ale může být způsoben také přímou interakcí alkoholů s pumpami....
|
|
|
Analýza zotavování membránového potenciálu kvasinek za stresových podmínek vyvolaných protonoforem CCCP
Babuka, David ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Sigler, Karel (oponent)
Diplomová práce se zabývá studiem odezvy vnitrobuněčného pH kvasinkových buněk na různá vnější prostředí, především ve vztahu k protonoforu karbonylkyanidu m-chlorophenylhydrazonu, CCCP. K měření vnitrobuněčného pH kvasinkových buněk jsme využívali geneticky kódovanou fluorescenční sondu poměrový pHluorin. S využitím metody synchronně skenovaných fluorescenčních spekter jsme byli schopni měřit vnitrobuněčné pH buněk s vysokou přesností. Jako součást těchto experimentů jsme studovali také jak vliv iontové síly pufrů buněčných suspenzí na povrchový potenciál kvasinek, tak vliv anorganické soli KCl na depolarizaci membrán kvasinek a acidifikaci cytosolu vyvolanou protonoforem CCCP. Zkoumali jsme jednak přímo změny cytosolického pH a jednak jsme toto naměřené pH používali jako indikátor procesů a stavu prostředí mimo buňku. K nejvýznamnějším výsledkům této práce patří vyvinutí nové metody monitorování velikosti povrchového potenciálu kvasinek pomocí titračních křivek acidifikace cytosolu vyvolané protonoforem CCCP.
|
|
|
Odezva membránového potenciálu a intracelulárního pH kvasinek na změny extracelulární koncentrace K+
Babuka, David ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent)
Bakalářská práce se zabývá studiem buněk kvasinek a jejich reakcí na různá vnější prostředí. Zkoumány byly především změny vnitrobuněčného pH a membránového potenciálu v závislosti na extracelulární koncentraci K+ iontů a jak jsou kvasinkové buňky schopny tyto změny kompenzovat. Jako doplněk k měření vnitrobuněčného pH, byla zkoumána schopnost kvasinek odolávat změnám pH vnějšího prostředí. Při měření vnitrobuněčného pH byla využita geneticky kódovaná fluorescenční sonda poměrový pHluorin a při měření změn membránového potenciálu byla použita fluorescenční sonda diS-C3(3). Úspěšně jsme také použili metodu synchronně skenované fluorescence, s jejíž pomocí jsme dokázali efektivně potlačit autofluorescenční signál buněk.
|
|
|
Srovnání vybraných karbocyaninových fluorescenčních sond z hlediska jejich použitelnosti při měření změn membránového potenciálu kvasinek.
Mudroňová, Kateřina ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Membránový potenciál je jednou z nejdůležitějších charakteristik živé buňky. Jednou z možností monitorování jeho změn je použití karbocyaninových fluorescenčních sond. V rámci této práce byly metodou synchronně skenované fluorescence prozkoumány vlastnosti několika sond. Z nich byly vybrány tři vhodné látky pro další experimenty jako doplněk k sondám diSC3(3) a diSC3(5), které představují standardní sondy používané v oddělení biofyziky FÚUK. Konkrétně se jedná o sondy diOC3(3), diIC1(3) a diIC2(5). Byla porovnána rychlost jejich akumulace v buňkách S. cerevisiae, na základě které jsme zjišťovali, zda jsou substráty MDR pump. Dále se tato práce zabývá otázkou ekvivalence výsledků obdržených pomocí různých fluoroforů a jejich vzájemného ovlivňování. Pro tyto účely byla zvolena dvojice sond diSC3(3) a diSC3(5), pomocí nichž byl zkoumán vliv acidifikace na membránový potenciál kvasinek S. cerevisiae. Bylo zjištěno, že informace o depolarizaci získané pomocí odlišných sond, se dobře shodují.
|
|
|
Srovnání fluorescenčních sond disC3(3) a diSC3(5) z hlediska jejich použitelnosti při měření změn membránového potenciálu kvasinek.
Matunová, Petra ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Membránový potenciál představující napětí na membráně je důležitý parametr pro studium buněčných procesů. Pomocí karbocyaninových sond diS-C3(3) a diS-C3(5), označovaných společným názvem 3,3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide, lze monitorovat změny membránového potenciálu buněk, které jsou příliš malé pro zavedení mikroelektrod. Tyto změny lze sledovat v jednotkách mV. Spektrální analýza buněčných suspenzí kvasinek S. cerevisiae s fluorescenčními sondami umožňuje stanovit koncentrace extracelulárního a intracelulárního fluorescenčního barviva, z jejichž znalosti lze určit hodnoty změn membránového potenciálu, které je možné vyvolat vnějšími podněty. Součástí práce je porovnání akumulace obou fluorescenčních sond a také experimenty zacílené na sledování vlivu vybraných látek a jejich měnících se koncentrací na volnou a vázanou složku barviva.
|
|
|
Studium exprese MDR pump u kvasinek Saccharomyces cerevisiae za různých růstových podmínek: metoda s fluorescenční sondou diS-C3(3)
Zahumenský, Jakub ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
V tejto práci sme študovali dva kvasinkové transportéry z rodiny ABC, Pdr10p a Pdr15p. V čase zadania diplomovej práce sa verilo, že tieto proteíny prispievajú ku kvasinkovému MDR fenotypu (PDR) na základe ich vysokej homológie s iným kvasinkovým MDR proteínom, Pdr5p. Aby sme tieto pumpy mohli študovať, boli pripravené dve izogénne skupiny mutantných kmeňov s deletovanými génmi kódujúcimi tieto proteíny, vo všetkých možných kombináciách delécií. Ukázalo sa, že oba tieto proteíny sú veľmi dôležité pri udržiavaní normálneho mikrookolia plazmatickej membrány pre najhojnejší, a esenciálny, kvasinkový membránový proteín, H+ -ATPázu, a tak ovplyvňujú membránový potenciál. Proteíny Pdr10p a Pdr15p tak hrajú doposiaľ neznámu úlohu pri regulácii tohoto enzýmu. Ďalej sa ukázalo, že delécia génov kódujúcich tieto proteíny výrazne znižuje možnosť aktivácie H+ -ATPázy protonofórom CCCP, ktorý je slabou kyselinou. Štúdie s imunosupresantom FK506 ďalej ukazujú, že táto látka znižuje životaschopnosť mutantného kmeňa S. cerevisiae PLY643, ktorý má deletované gény kódujúce Pdr5p, Snq2p a Yor1p. Ďalšie delécie Pdr10p a Pdr15p nezvyšujú letalitu tejto látky. Ani FK506 ani CCCP nie sú substrátmi študovaných púmp. 1
|
host ::
RSS.