|
|
Biokrystalizace jako nový koncept vývoje piezoelektrických materiálů pro biomedicínské využití
Dobešová, Kateřina ; Plichta, Tomáš (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřená na metody biofilamentace a biokrystalizace bakteriálních buněk producenta polyhydroxyalkanoátů, konkrétně bakterie Cupriavidus necator H16. Mezi hlavní metody použité na orientaci buněk patří spincoating a akustická vlna. Biokrystalizace byla vyvolána pomocí teplotního, osmotického a acidického stresu. Míra orientace buněk byla sledována mikroskopem atomárních sil, krystalizace pomocí FTIR. Mimo jiné byla určena tloušťka vrstev pomocí profilometru. Množství PHA v bakteriálních buňkách bylo stanoveno pomocí plynové chromatografie. Příprava krystalických uspořádaných vrstev biomateriálů představuje cestu k piezoelektrickým biomateriálům.
|
|
|
Možnosti využití vibrační spektroskopie při in-situ analýze PHA v mikrobiální biomase
Kevélyová, Barbora ; Samek, Ota (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Cieľom tejto diplomovej práce bolo štúdium polyhydroxyalkanoátov v mikrobiálnej biomase pomocou metódy ATR-FTIR. Ďalej bola zvolená štatistická metóda PCA pre vyhodnotenie nameraných dát a pozorované korelácie či odlišnosti. Bakteriálny producenti boli Aneurinibacillus thermoaerophilus H1, AH30 a AFn2, Cupriavidus malaysiensis DSM 25816, DSM 19416 a DSM 19379 a tri kmene Schlegelella thermodepolymerans M 15344, DSM 15264 a LMG 21645. Skúmané boli rozličné heteropolyméry s rôznym obsahom monomérov a celkovým obsahom PHA. Monoméry vo vzorkách boli 3-hydroxybutyrát, 4-hydroxybutyrát, 3-hydroxyvalerát, 4-hydroxyvalerát, 5-hydroxyvalerát a 4-hydroxyhexanoát. Ako porovnávacia analýza pre presné kvantitatívne a kvalitatívne stanovenie polyhydroxyalkanoátov vo vzorkách bola prevedená plynová chromatografia. Spektrá získané metódou FTIR boli porovnávané a boli hľadané signifikantné píky, ktoré súvisia s kvalitatívnymi vlastnosťami PHA, konkrétne monomérnym zložením a stupňom kryštalinity. Na zozbierané dáta z FTIR bola úspešne aplikovaná štatistická metóda PCA, pomocou ktorej boli sledované najmä kvalitatívne rozdiely medzi vzorkami. Najdôležitejšie rozdiely boli pozorované v prípade prítomnosti monoméru 4-hydroxybutyrátu a 4-hydroxyhexanoátu, a týkali sa stupňa kryštalinity vzoriek. Analýza nepreukázala potenciál pri semi-kvantitatívnom stanovení PHA v biomase. Rozdiely medzi mikroorganizmami neboli pozorované. Postup vyhodnotenia FTIR spektier pomocou PCA by bolo vhodné do budúcna využiť pri štúdiu biomasy s obsahom rozličných monomérnych jednotiek, najmä hydroxyvalerátov v prípade ich vyššieho obsahu vo vzorke.
|
|
|
Charakterizace povrchových a mechanických vlastností mikrobiálních buněk
Khýrová, Markéta ; Lukeš,, Jaroslav (oponent) ; Plichta, Tomáš (vedoucí práce)
Předmětem této diplomové práce je charakterizace bakteriálních kmenů schopných produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA) z hlediska morfologie a mechanických vlastností. Za tímto účelem byl použit mikroskop atomárních sil (AFM) spolu s nanoindentačním přístrojem, kde byly provedeny mikrokompresní testy na zvolených mikroorganismech. Modelové bakteriální kmeny, Cupriavidus necator a Rhodospirillum rubrum, byly testovány ve formě produkující PHA i v jejich mutantní variantě PHA neprodukující, za účelem studia vlivu množství PHA na morfologii i mechanické vlastnosti bakterií. Experimentální část této práce zahrnuje nejprve optimalizaci přípravy vzorků nativních bakterií pro obě techniky, kdy byly upravovány skleněné substráty pomocí plazmatu a buňky následně fixovány pomocí Poly-L-lysinu. Pro mikrokompresní testy byla navíc optimalizována i příprava vzorků včetně fluorescenčního barvení s cílem snadné detekce a určení rozměrů buněk. V neposlední řadě byly hodnoceny vlivy různých parametrů měření a výpočetních modelů na data získaná z AFM. Výsledky odhalily vliv PHA na morfologii bakteriálních buněk a ukázaly, že producenti PHA vykazují průměrně vyšší Youngův modul oproti jejich příslušné mutantní variantě. Experimentálně též bylo prokázáno, že mikrokompresní testy poskytují významně vyšší hodnoty Youngova modulu než tato veličina stanovená pomocí AFM.
|
|
|
Vliv elektrochemicky generovaného peroxidu vodíku na stresovou odpověď mikroorganismů za účelem zvýšené produkce PHA
Najbrtová, Johana ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Ehlich, Jiří (vedoucí práce)
Předmětem předložené diplomové práce je vliv elektrochemicky tvořeného peroxidu vodíku na produkci polyhydroxyalkanoátů. Peroxid vodíku byl v této práci generován přímo v kultivačním médiu s bakteriemi, a to dvouelektronovou redukcí kyslíku. Tato práce je dělena na teoretickou část, která se věnuje přiblížení tématiky polyhydroxyalkanoátů, oxidativního stresu, elektrochemické produkce H2O2 a propojení elektrochemie s biotechnologií. Experimentální část je zaměřena na aplikaci těchto poznatků. Peroxid vodíku byl generován aplikací elektrického potenciálu na elektrodový systém složený konkrétně z nerezové ocelové pracovní elektrody, titanové protielektrody a pseudoreferenční Ag/AgCl elektrody vložených do polypropylenového držáku. Po počáteční elektrochemické charakterizaci připraveného systému byl vybrán potenciál -0,8 V a -1 V pro aplikaci v kultivačních experimentech. Zde byl zkoumán vliv H2O2 na stresovou odpověď bakterie Cupriavidus necator H16 z České sbírky mikroorganismů. Z výsledků kultivačních experimentů bylo patrné, že elektrochemicky produkovaný H2O2 nemá výrazný vliv na vývoj bakteriální kultury. Avšak samotný elektrodový systém pozitivně ovlivňuje bakteriální růst. Vliv H2O2 nebyl patrný z důvodu nízké produkce v médiu. Ta byla způsobena nízkou koncentrací kyslíku v objemu kultivačního média. V průběhu práce byl navrhnut nový elektrodový systém s vyšší tvorbou H2O2, který mohl využívat vzdušného kyslíku pro redukci na H2O2. Avšak ani s tímto systémem nebylo dosaženo chtěné stresové odpovědi bakterie, jelikož zvýšené tvorbě H2O2 bránil biofilm vzniklý na elektrodách. Dále bylo v práci zjištěno, že materiály použité na elektrodový systém podporují tvorbu biofilmu, a to hlavně titan, nerezová ocelová mřížka a polypropylen.
|
|
|
Production of polyesters by extremophilic bacteria
Bednárová, Kristína ; Mravec, Filip (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This bachelor thesis deals with the study of the production of polyhydroxyalkanoates using thermophilic bacterial strains Schlegelella thermodepolymerans, Schlegelella aquatica and Thermomonas hydrothermalis. The aim of the thesis is to optimize the conditions of polymer production. In bacterial strains of the genus Schlegelella, phaC gene at the genotype level was confirmed. The ability to produce polyhydroxyalkanoates in the bacterial strain Thermomonas hydrothermalis at the phenotype level was demonstrated. The utilization of selected carbon sources was studied experimentaly. The production of PHA was optimized by selecting the appropriate substrate and cultivation temperature. The effect of precursors on the production of copolymers P(3HB-co-4HB) and P(3HB-co-3HV) was observed. The most promising carbon substrate for bacterial strain Schlegelella aquatica was glycerol while the best metabolic activity was at 45 °C. Strain Thermomonas hydrothermalis was able to produce the copolymer P(3HB-co-4HB) with extreme high molar fraction of 4HB. Optimal cultivation temperature was 55 °C. The highest yield of P(3HB) among selected bacteria, synthesized Schlegelella thermodepolymerans cultivated on xylose at 55 °C. For this strain, the effect of aeration on biomass growth and PHA production was observed. In an effort to reduce production costs, Schlegelella thermodepolymerans was cultivated on model hydrolysates of lignocellulose-rich materials. Finally, batch cultivation in a larger production volume in laboratory fermentor was performed.
|
|
|
Zapojení polyhydroxyalkanoátů do stresové odpovědi bakterií v pozdní stacionární fázi
Šuráňová, Zuzana ; Sedláček, Petr (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem bakalářské práce bylo studium zapojení polyhydroxyalkanoátů (PHA) do stresové odpovědi bakterií v pozdní stacionární fázi. Pro tento experiment byly vybrány bakterie Cupriavidus necator H16 (schopná produkovat PHA) a Cupriavidus necator H16/PHB-4 (neschopná produkovat PHA). V teoretické části byla zpracována literární rešerše zabývající se polyhydroxyalkanoáty a stresovou odpovědí bakterií. V praktické části bylo studováno zapojení polyhydroxyalkanoátů do stresové odpovědi bakterií v pozdní stacionární fázi vůči vybraným stresovým faktorům. Byla studována odolnost bakterií vůči různým stresovým podmínkám. V průběhu dlouhodobých kultivací byla posouzena viabilita a distribuce PHA v bakteriálních buňkách pomocí průtokové cytometrie a obsah PHA v biomase byl analyzován pomocí plynové chromatografie s FID detektorem. Na základě výsledků získaných v této práci bylo zjištěno, že bakterie PHA akumulující Cupriavidus necator H16 lépe odolává limitaci uhlíkatým zdrojem a také vykazuje vyšší odolnost vůči některým stresovým faktorům ve stacionární fázi než PHA neprodukující bakterie Cupriavidus necator H16/PHB-4, jako je aplikace ethanolu a zmražení.
|
|
|
Centrifugační analýza mikrobiálních buněk
Beránková, Barbora ; Müllerová, Lucie (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá studiem centrifugačního potenciálu mikroorganismů v závislosti na kultivačních podmínkách. V experimentální části byla sledována především rychlost sedimentace a index nestability studovaných mikroorganismů během růstu, při působení teplotního a solného stresu, vliv složení média na centrifugaci a působení vody na halofilní bakterii Haloferax mediterranei. S klesající osmotickou sílou v bakteriální kultuře Haloferax mediterranei roste rychlost sedimentace a index nestability. Při sledování růstu bakterií Cupriavidus necator H16, Cupriavidus necator PHB-4, Haloferax mediterranei, Burkholderia cepacia a Burkholderia sacchari hraje roli při rychlosti sedimentace a indexu nestability přítomnost a typ polyhydroxyalkanoátu (PHA) v bakteriální biomase. Bakterie Cupriavidu necator H16 s nejvyšším přítomným obsahem poly(3-hydroxyburyrátu) byla nejrychleji sedimentující a nejvíce nestabilní ze sledovaných bakterií. Bakterie Cupriavidus necator H16 a její PHA neprodukující mutant Cupriavidus necator PHB-4, vystavené teplotnímu a solnému stresu, vykazovaly při teplotním stresu pouze nepatrný vliv na rychlost sedimentace a nestabilitu. U solného stresu s rostoucí koncentrací roztoku NaCl v kultuře klesala rychlost sedimentace a index nestability. Při porovnávání vlivu složení média na polyhydroxyalkanoáty (PHA) produkující bakterie, Cupriavidus necator H16 kultivovaná v minerálním (produkčním) médiu vykazovala nejnižší rychlost sedimentace a index nestability, přičemž Cupriavidus necator PHB-4 dosahovala nejnižší rychlosti sedimentace a indexu nestability při kultivaci v Nutrient Broth médiu. U kvasinky Saccharomyces cerevisiae měla volba média pouze nepatrný vliv na rychlost sedimentace a index nestability.
|
|
|
Study on metabolism of polyhydroxybutyrate and glycogen in cyanobacteria
Drinka, Jakub ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
The submitted diploma thesis is focused on establishing a quantification method for glycogen analysis in cyanobacterial cells in order to be able to consider the impact of illumination and other parameters on accumulation of reserve polymers, glycogen and polyhydroxyalkanoates (PHA), namely poly(3-hydroxybutyrate) (PHB). The experiments were conducted with two cyanobacterial species, Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechocystis salina CCALA 192, which were grown both in Erlenmayer flasks (EF) and multicultivator (MC). The methodology for glycogen accumulation was introduced based on available literature and conducted optimalization. The effect of different illumination conditions was observed in a nitrogen-limiting media M22O, in which half of the cultures were cultivated with a 16 hours of light and 8 lights of darkness periods (EF) for the whole duration of the experiment. Others were transfered into full-time dark period after entering the dormant chlorosis state, following the exhaustion of nitrogen levels in the media. Synechocystis sp. PCC 6803 showed a decrease in both of the reserve polymers accumulation when introduced to this type of stress conditions. On the other hand, Synechocystis salina CCALA 192 converted some of the glycogen into PHB in the dark, but the polyester levels were lower than those of the cultures continuously cultivated under the lamp. A negative effect on the biomass concentration was also detected, while cyanobacterial pigments seemed to be unaffected by the lack of light, their levels in the EF that remained illuminated decreased due to chrolosis. The experiments in the MC were conducted in the same way, but the light period consisted of constant, 24-hour illumination. Synechocystis sp. PCC 6803 seemed to follow a different trend than in cultivations in EF, the PHB concentration was not affected by the dark period and remained on the same amounts, while glycogen was metabolised. Synechocystis salina CCALA 192 increased its polyester reserves in the darkness and in comparison with the first species accumulated almost 4 times more PHB. However, the results acquired from cultivations in MC seemed to be very unequal due to a lot of small differences in the cultivation conditions. That was the reason why in the later stages of experiments they were focused more on a possible PHA copolymer formation, rather than comparing the functions of these two reserve polymers in the light/dark cycles. However, none of the cultivations was succesful in this matter and no monomer other than 3-hydroxybutyrate (3HB) was detected in the dried biomass.
|
|
|
Využití vibrační spektroskopie při in-situ kvalitativní a kvantitativní analýze polyhydroxyalkanoátů v bakteriální biomase
Kevélyová, Barbora ; Enev, Vojtěch (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Cieľom tejto bakalárskej práce bolo zhodnotiť využiteľnosť vybranej metódy vibračnej spektroskopie pre kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu biomasy, ktorá obsahuje polyhydroxyalkanoáty. Bola zvolená metóda infračervenej spektroskopie s Fourierovou transformáciou, ktorá využíva tzv. zoslabený úplný odraz (ATR-FTIR). Poly(3-hydroxybutyrát-co-4-hydroxybutyrát) bol skúmaný v baktériách Cupriavidus malaysiensis, Thermomonas hydrothermalis a Aneurinibacillus thermoaerophilus sp. H1. Vyhodnotením infračervených spektier boli získané dáta, ktoré sa následne porovnali s výsledkami prevedenej plynovej chromatografie. Boli tiež pozorované vizuálne zmeny v spektrách a stav kryštalinity. Pri kvantitatívnej analýze kopolyméru v biomase metódou ATR-FTIR nebola pozorovaná korelácia dát s výsledkami plynovej chromatografie. Táto metóda teda nie je vhodná pre stanovenie celkového obsahu poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) v biomase v prípade nami nastaveného experimentu a použitých baktérií. Na druhej strane bola daná metóda úspešne využitá pri kvalitatívnej analýze kopolyméru in-situ v biomase producenta Aneurinibacillus thermoaerophilus sp. H1. Miera korelácie dát bola v danom experimente dosť vysoká. ATR-FTIR je teda vhodná analytická metóda pre stanovenie monomérneho zloženia kopolyméru poly(3-hydroxybutyrát-co-4-hydroxybutyrát) priamo v biomase pri tejto baktérií. Porovnaním s producentom Cupriavidus malaysiensis sa ukázalo, že táto metóda nie je univerzálna pre všetky typy nami skúmaných mikroorganizmov.
|
|
|
Produkce polyhydroxyalkanoátů pomocí Haloferax mediterranei
Hlináková, Kristýna ; Kučera, Dan (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená bakalářská práce je zaměřena na studium vybraných vlivů na produkci biopolymerů, polyhydroxyalkanoátu (PHA) a extracelulárních polysacharidů (EPS), extrémně halofilní Archae Haloferax mediterranei. V teoretické části je zpracována stručná charakteristika biopolymerů a přehled příslušných mikrobiálních producentů. Experimentální část byla zaměřena na výběr vhodného substrátu, koncentraci soli a glukózy v médiu pro optimální produkci biopolymerů. Dalšími studovanými vlivy byla přítomnost světla a vhodná kultivační teplota. Pro stanovení biomasy byla zvolena metoda UV-VIS spektrofotometrie a gravimetrická metoda. PHA byly analyzovány pomoci plynové chromatografie s FID detekcí. Konkrétním PHA, produkovaným pomoci H. mediterranei, je kopolymer P(3HB-co-3HV). Obsah 3HV v kopolymeru se pohybuje okolo 10 %. Pro produkci PHA se jako nejlepší substrát osvědčila směs glukózy a glycerolu, kdy bylo dosaženo až 80,6% PHA v sušině. Dále byla optimalizována osmotická síla prostředí, kde se z pohledu akumulace PHA nejlépe osvědčila koncentrace NaCl 200 g/l. Je zajímavé, že na různou iontovou sílu prostředí reagovala kultura odlišnou pigmentací. Posledním klíčovým parametrem, který byl optimalizován v rámci této práce, byla teplota. Nejvyšší výtěžek PHA byl zaznamenán při teplotě 37°C, nicméně kultura byla schopna růst a akumulovat PHA i při teplotě 50°C.
|
host ::
RSS.