|
|
Vliv optimalizace genu na rekombinantní expresi lidského cytochromu P450 3A4
Svobodová, Barbora ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Cytochrom P450 3A4 je integrální protein vyskytující se v membráně endoplasmatického retikula. U člověka se v nejvyšší míře vyskytuje v jaterní tkáni. Je důležitým enzymem metabolismu xenobiotik. V procesech biotransformace přeměňuje zhruba polovinu všech používaných léčiv. Hlavním cílem diplomové práce bylo ověřit vliv genové optimalizace na heterologní expresi lidského cytochromu P450 3A4. Při řešení práce byly nejprve připraveny a ověřeny expresní konstrukty založené na vektoru pET22b. Byla porovnána efektivita exprese zkrácené formy zájmového proteinu za použití syntetického genu optimalizovaného pro produkci v hostitelském organismu odvozeném od parentálního kmene K-12 vůči produkci stejně zkráceného cytochromu P450 3A4 v témže vektoru ovšem s originálním lidským genem získaným z cDNA. Bylo potvrzeno, že optimalizace nukleotidové sekvence genu pro hostitelský organismus E. coli skutečně činnost exprese zkrácené formy proteinu zvyšuje, i když množství aktivní formy proteinu nedosahuje výtěžků obvyklých u jiných netoxických solubilních proteinů. Kromě toho byl učiněn pokus o produkci kompletní nezkrácené formy lidského cytochromu P450 3A4 v expresním vektoru pET22b. Množství této formy proteinu přítomné v bakteriální membránové frakci však bylo ve srovnání se zkrácenou formou mnohem nižší....
|
|
|
Vliv propan-2-olu na strukturu cytochromu c v kyselé oblasti pH
Drahorád, Jan ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
: Ve své práci se věnuji konformačním změnám cytochromu c - jeho denaturaci a případnému vytvoření stavu "molten globule". Zkoumal jsem vliv propan - 2 - olu na konformaci cytochromu c v kyselé oblasti pH. Součástí práce je literární rešerše na téma cytochrom c : Cytochrom c je mitochondriální periferní hemoprotein, který slouží jako přenašeč elektronů v dýchacím řetězci. Mimo jiné má také funkci v apoptóze. Jeho vlastnosti jsem zkoumal pomocí spektrofotometrických metod, zvláště pak pomocí absorpčních spekter a jejich derivací. Zaměřil jsem se na rozsah vlnových délek 250 - 310 nm, 300 - 500 nm a 450 - 650 nm. Proměřoval jsem pufry s rozpuštěným cytochromem c při pH 1,90; 2,10; 2,30 a 2,60 a zkoumal konformační změny zapřičiněné perturbací propan - 2 - olem až do 20% objemového zlomku. Největší konformační změny se dějí při perturbaci při pH 2,30.
|
|
|
Výskyt a význam konformace "molten-globule" v proteinech
Plutinský, Martin ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
Součástí práce je literární rešerše na téma molten globule. Tento konformační stav vzniká obecně v roztocích některých bílkovin za použití mírných denaturačních podmínek jako termodynamicky stabilní stav. Někdy se pozoruje při zpětném sbalování meziprodukt taky s vlastnostmi molten globule. Předpokládá se, a u některých proteinů to bylo i prokázáno, že molten globule je identická při rozbalování a zpětném sbalení do nativního stavu. Druhá část práce se věnuje konformačním změnám ferricytochromu c z koňského srdce při pH v kyselé oblasti s i bez přídavku 0,5 M chloridu sodného. Cytochrom c je mitochondriální bílkovina sloužící jako mobilní přenašeč v dýchacím řetězci. Konformační změny jsem sledoval pomocí metody UV/VIS a derivační spektroskopie ve čtyřech oblastech absorpčního spektra cytochromu c - oblast absorpce aromatických aminokyselin, Soretův pás, Q pás a CT pás. Přítomnost chloridových aniontů (zvýšená iontová síla) stabilizuje pravděpodobně konformační stav molten globule v rozsahu pH 1,90-2,60. V roztocích bez přídavku soli jsem pozoroval změny polarity v okolí tyrosinových a tryptofanového zbytku (mezi pH 2,60 a 2,30) tak změny ve spinových stavech železa (kolem pH 2,10) v důsledku denaturace proteinu.
|
|
|
Syntéza 5'-UTR varianty PSM-E genu GCPII jako standardu pro RT-PCR
Růžičková, Barbora ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
V poslední době se pro chemickou syntézu genů stala klíčovým prvkem metoda PCR. V této práci byla využita dvoukroková syntéza DNA založená na PCR k získání 5'-UTR sestřihové varianty PSM-E glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) jako standardu pro qPCR v reálném čase. Dalším cílem práce bylo zaklonovat tuto sekvenci do plazmidu PCRII-TOPO PSM-E, aby mohla být použita k expresi proteinu v hmyzích buňkách v baculovirovém expresním systému. V první PCR reakci byl syntetizován střed sekvence 5'- UTR, který byl následně amplifikován v druhé PCR reakci pomocí prvního a posledního oligonukleotidu. Produkt druhé PCR reakce byl ligován do plasmidu pUC19 a tímto kostruktem byly transformovány bakterie E. coli. Správnost sekvence byla potvrzena sekvenční analýzou. Dále bylo provedeno subklonování insertu z pUC19 do pCRII-TOPO PSM-E a sekvence byla opět ověřena sekvenční analýzou. Získaný konstrukt byl použit jako standard v qPCR v reálném čase ke stanovení koncentrace vzorků mRNA z tkání prostat onkologických pacientů přepsaných reverzní transkripcí do cDNA. Z naměřených amplifikačních křivek standardu byla vytvořena kalibrační křivka, ze které byly odečteny hodnoty koncentrací vzorků cDNA.
|
|
|
Heterologní exprese lidské NADPH:cytochrom P450 reduktasy
Mazurová, Martina ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
Se studiem karcinogenese přímo souvisí studium metabolismu xenobiotik, neboť ta se mohou na vzniku rakoviny podílet. Systém monooxygenas se smíšenou funkcí, který se na odbourávání cizorodých látek významně podílí, je v laboratoři, v níž byla práce prováděna, studován především pomocí experimentů in vitro. Pro získání potřebných rekombinantních enzymů se v současnosti hojně využívá metoda heterologní exprese. V této práci byla tato metoda použita pro přípravu lidské NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasy, membránového enzymu, který redukuje cytochrom P450 a tím umožňuje jeho katalytickou aktivitu. Byly připraveny a ověřeny vektory, nesoucí syntetický gen pro lidskou NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasu, založené na plasmidech pUC19 a pET22b. Reduktasa byla produkována v buňkách E. coli BL21-Gold a E. coli BL21-CodonPlus-RIL. Celková produkce proteinu v buňkách byla vysoká, problémem však bylo, že vznikající protein byl přítomen převážně v inkluzních tělískách. Byly částečně optimalizovány podmínky exprese tak, aby zvětšil podíl nativního proteinu v bakteriální membránové frakci.
|
|
|
Vztah mezi mutagenitou a rozpustností nitrobenzanthronů ve vodných i nevodných rozpouštědlech
Řeboun, Martin ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
2-Nitrobenzanthron a 3-nitrobenzanthron jsou polutanty široce zastoupené v životním prostředí. Mezi jejich zdroje se řadí automobilismus, ale třeba i spalování dřeva. 3-NBA je prokázaným mutagenem karcinogenem pro bakteriální a savčí systémy a je to pravděpodobný lidský mutagen. Po metabolické aktivaci může tvořit adukty s purinovými bázemi v molekule DNA. 2-NBA vykazuje o 3-4 řády nižší genotoxicitu, jedním z mechanismů přispívajícím k tomuto jevu může být velký rozdíl v rozpustnosti těchto izomerů, a tedy rozdíl v jejich biologické dostupnosti. Jedním z cílů práce bylo stanovit rozpustnost 3-NBA a 2 NBA ve vodném a v methanolovém roztoku. Dílčím cílem bylo stanovení jejich extinkčních koeficientů pro výše uvedené roztoky. Pro tato stanovení byly použity dvě různé metody. První metoda měření rozpustnosti byla založena na přidávání zásobního roztoku 3/2-NBA v dimethylsulfoxidu a spektrofotometrickém měření v oblasti platnosti Lambert-Beerova zákona. Další hodnoty rozpustnosti byly získány spektrofotometrickým stanovením koncentrací látek v roztoku nad sraženinou. U vodných roztoků 2-NBA byly hodnoty získány extrapolací. Klíčová slova: rozpustnost, UV-VIS spektroskopie, 3-nitrobenzanthron, 2- nitrobenzanthron
|
|
|
Asymetrická biotransformace beta-tetralonů na příslušné alkoholy
Andrejch, Jan ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
Příprava čistých enantiomerů je v současnosti klíčovou součástí chemické syntézy mnoha průmyslově a farmaceuticky významných látek a trendem posledních let je postupný odklon od tradiční chemické syntézy k využívání biotransformací. Biotransformace znamená využívání izolovaných enzymů, celých enzymových systémů nebo celých buněk ke katalyzování chemických reakcí a oproti chemické syntéze přináší řadu výhod. V této práci byla prověřována biotransformační aktivita kvasinkových kmenů Saccharomyces uvarum K8, Saccharomyces cerevisiae K12, Torulopsis azyma K43, Torulopsis sphaerica K46 a Candida tropicalis K49, K51 a K52 při katalýze redukce 6-bromo-2-tetralonu, 7-hydroxy-2-tetralonu a 7-methoxy-2-tetralonu na příslušné alkoholy, což je významný reakční krok při syntéze některých léčiv. Byly nalezeny vhodné reakční podmínky pro biotransformaci a zjištěno, že kmeny Saccharomyces uvarum K8 a Candida tropicalis K52 jsou schopny poskytovat 2-tetraloly s ee vyšším než 90% při současné 100% konverzi substrátu při čtyřhodinové biotransformaci.
|
|
|
Vliv propan-2-olu na strukturu cytochromu c v kyselé oblasti pH
Drahorád, Jan ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
: Ve své práci se věnuji konformačním změnám cytochromu c - jeho denaturaci a případnému vytvoření stavu "molten globule". Zkoumal jsem vliv propan - 2 - olu na konformaci cytochromu c v kyselé oblasti pH. Součástí práce je literární rešerše na téma cytochrom c : Cytochrom c je mitochondriální periferní hemoprotein, který slouží jako přenašeč elektronů v dýchacím řetězci. Mimo jiné má také funkci v apoptóze. Jeho vlastnosti jsem zkoumal pomocí spektrofotometrických metod, zvláště pak pomocí absorpčních spekter a jejich derivací. Zaměřil jsem se na rozsah vlnových délek 250 - 310 nm, 300 - 500 nm a 450 - 650 nm. Proměřoval jsem pufry s rozpuštěným cytochromem c při pH 1,90; 2,10; 2,30 a 2,60 a zkoumal konformační změny zapřičiněné perturbací propan - 2 - olem až do 20% objemového zlomku. Největší konformační změny se dějí při perturbaci při pH 2,30.
|
|
|
Příprava rekombinantního lidského cytochromu b5
Hálková, Tereza ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
Cytochrom b5 je malý hemový protein. V lidském organismu se vyskytuje ve třech formách, a to vázaný v membráně endoplasmatického retikula (mikrosomální cyt b5) nebo ve vnější mitochondriální membráně, ale také jako solubilní forma v cytoplasmě maturovaných erytrocytů. Cytochrom b5 slouží zejména jako jednoelektronový přenašeč při různých reakcích, včetně reakcí katalyzovaných cytochromy P450. Jedním z cílů předkládané diplomové práce bylo připravit a izolovat solubilní králičí cytochrom b5, a to metodou heterologní exprese v Escherichia coli BL 21 Gold. Pro expresi byl použit expresní vektor založený na plasmidu pET22b, který nesl syntetický gen kódující králičí mikrosomální cytochrom b5, u něhož byla odstraněna část kódující C-terminální membránovou kotvu. Dále byly syntetizovány geny kódující lidský erytrocytární a mikrosomální cytochrom b5. Geny pro lidské cytochromy b5 byly vloženy do klonovacího vektoru pUC19, amplifikovány v kompetentních buňkách E. coli DH5α a verifikovány DNA sekvenací. Následně byly zkonstruovány a ověřeny expresní vektory pET22b obsahující geny kódující lidský mikrosomální a erytrocytární cytochrom b5. Klíčová slova: Heterologní exprese, genová syntéza, lidský cytochrom b5, izolace
|
|
| |
host ::
RSS.