|
|
Využití molekulárních technik k charakterizaci kvasinek rodu Metschnikowia
Schneiderwindová, Nicole ; Brázda, Václav (oponent) ; Němcová, Andrea (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá možnostmi provedení a využití molekulárních metod k charakterizaci kvasinek rodu Metschnikowia a také aplikací metod v biotechnologiích případně v potravinářském průmyslu. V teoretické části je zaměřená na stručný popis kvasinek, zejména vybraných druhů, které se používaly během praktické části, možnosti jejich využití, a především na detailní popis všech použitých molekulárních technik. V praktické části se zaměřuje na optimalizaci použitých molekulárních metod, konkrétně metody pulzní gelové elektroforézy (PFGE) a metody denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE). Na začátku byla provedena kultivace kvasinek za optimálních podmínek, které jsou pro tento rod specifické. Dále byla pomocí izolačních technik izolována jejich DNA, která byla následně podrobena zpracování pomocí metod PFGE a PCR–DGGE. Nejvíce bylo třeba optimalizovat postup izolace DNA. Bylo provedeno několik optimalizací koncentrace lyzačních enzymů, zejména pak enzymu lytikázy. Také bylo potřeba stanovit správný poměr low-melting agarosy a izolované DNA, což bylo zásadní pro správnou konzistenci izolovaných DNA bločků a pro jejich další uplatnění při PFGE analýze. Nakonec byla provedena optimalizace metody PFGE, která přinesla správné rozdělení chromozomů, díky čemuž bylo možné jednotlivé chromozomy popsat dle jejich velikosti podle použitého standardu CHEF kvasinky Hansenula wingei. Pro správnou optimalizaci samotného procesu DGGE analýzy bylo třeba nejdříve izolovat kvasinkovou DNA pomocí kitu, tato DNA byla následně použita jako templát pro PCR reakci. Byla optimalizována také teplota annealingu pro jednotlivé skupiny použitých primerů. Amplikony, které byly získány pomocí této reakce byly separovány pomocí metody DGGE. U této techniky bylo zapotřebí především optimalizace základních parametrů jako je rozsah denaturačního gradientu či celkový čas separace. Dle výsledků měření lze určit, že postup izolace DNA kvasinek a jejich následná analýza pomocí molekulárních metod pulzní gelové elektroforézy a denaturační gradientové gelové elektroforézy byla úspěšná. Podařilo se nám alespoň částečně popsat genom a určit počet chromozomů u všech použitých druhů kvasinek rodu Metschnikowia.
|
|
|
Mutant p53 protein and its binding and transactivation properties
Vojsovič, Matúš ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The "genome guardian" protein p53 plays an important role in cancer growth. P53 mutations occur in more than 50 % of human cancers. Mutated proteins significantly affect the proper functioning of cells. Due to the mutation, proteins can gain, but also lose, some of their functions, which also help them in modulating cell metabolism. Mutant forms of p53 may be involved in indirect binding or direct binding to DNA. They appeared to have a lower binding activity to the DNA than non-mutated p53. The experimental part of the thesis focuses on measuring the binding properties of selected p53 mutants using gel retardation analysis and using an atomic force microscope and monitoring the transactivation potential. The results were compared with the wild-type form of p53. It has been found that binding to the most common types of local DNA structures reduces the binding activity of p53 mutants over the wild-type. P53 mutants has been shown to have a lower intensity of transactivation than the wild-type p53 by studying their transactivation abilities and also they are able to reduce the intensity of transactivation when co-expressed with p53.
|
|
|
Analýza lokalizace inverzních repetic v bakteriálních genomech
Šedý, Michal ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Inverzní repetice (IR) jsou přirozenou součástí DNA všech známých prokaryotických i eukaryotických organismů. Inverzní repetice mají důležitou roli při regulaci základních buněčných procesů. Jsou zodpovědné za vznik křížových struktur. Inverzní repetice taktéž zapříčiňují genomovou nestabilitu a mohou být zdrojem řady mutací. Křížové struktury mohou být rozeznávány celou řadou DNA vazebných proteinů a také mohou fungovat jako transkripční regulátory. Pomocí nástroje Palindrom analyser byla analyzována frekvence výskytu a lokalizace inverzních repetic v bakteriálních genomech. Frekvence výskytu inverzních repetic napříč bakteriálními genomy vykazuje variabilní charakter. Frekvence výskytu krátkých inverzní repetic vykazuje přibližně kvadratickou závislost na % obsahu GC párů v genomu s minimem okolo 50 % obsahu GC. Lokalizace inverzních repetic vzhledem k funkčním oblastem DNA vykazuje nenáhodný charakter rozložení. Frekvence výskytu IR u většiny sledovaných funkčních oblastí je vyšší „vně“ než „uvnitř“.
|
|
|
Vliv různých kosmetických polysacharidů jako prebiotik na mikrobiom kůže
Pelánová, Lenka ; Brázda, Václav (oponent) ; Němcová, Andrea (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce se zabývá sledováním vlivu polysacharidů, které se používají jako přísada do kosmetických výrobků, na sledované druhy bakterií, které jsou součástí mikrobiomu kůže. A také zkoumáním vlivu polysacharidů jako prebiotik na vybrané sledované druhy bakterií, které jsou součástí mikrobiomu kůže. V rámci stanovení účinků na mikrobiom kůže byly vybrány dva polysacharidy: Nanomoist a PoLevan S. První část práce se zaměřuje na literární rešerši, která se zabývá anatomií kůže, kožními onemocněními a kožním mikrobiomem a jeho funkcí. Experimentální část je zaměřena na sledování změn v množstevním zastoupení vybraných mikroorganismů mikrobiomu kůže, před a po aplikaci polysacharidů na kůži, pomocí qPCR. Sledovány byly bakterie Staphylococcus epidermidis, Cutibacterium acnes, Escherichia coli a Micrococcus luteus. PCR produkty byly detekovány pomocí agarózové gelové elektroforézy. Bakterie Staphylococcus epidermidis byla na kůži detekována v největší míře a to zejména po aplikaci polysacharidů Nanomoist a PoLevan S. Byl tedy zjištěn pozitivní vliv obou polysacharidů na růst této bakterie.
|
|
|
Bioinformatic analysis of PHA synthases of thermophilic bacteria
Brondová, Zuzana ; Brázda, Václav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
The thesis deals with bioinformatics analysis, the aim of which was to find a suitable producer of PHA for new generation industrial biotechnologies from the collection of found thermophilic bacteria. Part of experiments was the finding of several thermophilic bacteria based on the similarity of the protein sequence of the phaC gene of the bacterium Cupriavidus necator. The next part of thesis was a literature search of the abilities of these thermophilic bacteria focused on culture conditions and the spectrum of usable substrates. Subsequently, five bacteria were selected for use in NGBI based on the information obtained. Freely available databases were used during the experimental work, and evolutionary analysis were performed in MEGA X and Operon-mapper. Rubrobacter xylanophilus with collection number DSM 9941 was selected from the collection of bacterial strains as the most promising PHA producer for NGIB. The high culture temperature of up to 70 ° C and a large amount of utilized carbohydrate substrates were considered decisive. An interesting result of the analysis was to find the gene sequences of two classes of PHA synthase – I. and III. class, as for a single bacterial strain from the entire collection. Additional genes linked to PHA metabolism were found in genome analysis.
|
|
|
Využití kvasinkového isogenního systému pro studium interakcí proteinu IFI16 s DNA
Kratochvilová, Libuše ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovaného proteinu 16 (IFI16) k sekundárním lokálním strukturám G-kvadruplexu (G4) a jeho mutacím v jednohybridním kvasinkovém systému (Y1H). Protein IFI16 v buňce rozpoznává vlastní a cizorodou nebo poškozenou DNA, podílí se na tvorbě inflamazomu a indukuje expresi interferonu typu I (IFN-I). Rovněž má podíl na regulaci transkripce a restrikci virové infekce. Bylo prokázáno, že protein IFI16 se preferenčně váže ke strukturám G-kvadruplexů a je schopen je touto vazbou stabilizovat. G-kvadruplexy jsou řazeny mezi nekanonické struktury DNA a RNA tvořené sekvencemi bohaté na G. Snadno jsou tvořeny za fyziologických podmínek a nachází se v řadě významných regulačních strukturách genomu jako jsou telomery nebo promotory onkogenů. Jsou také součástí řady virových genomů. To z nich dělá vynikající potenciální cíle při léčbě nádorových a virových onemocnění. V první experimentální části práce byly připraveny nové reportérové kmeny kvasinek S. cerevisiae metodou Delitto Perfetto, které se lišily pouze v sekvenci s potenciálem tvorby G-kvadruplexu, které byly navrženy a analyzovány programem DNA Analyser. Správnost vkládaných sekvencí byla ověřena PCR a Sangerovým sekvenováním a srovnáním s dodanými sekvencemi oligonukleotidů programem Blast. V druhé části práce byly nově připravené kmeny transformovány vektory pro expresi proteinů p53, IFI16 a posuzován vliv vazby IFI16-G4 na expresi reportérového genu ve spojitosti s nádorovým supresorem p53 s využitím luciferázových reportérových testů. Vyhodnocení proběhlo na základě statistické analýzy velikostí účinků získaných po normalizování signálu luminescence na optickou hustotu kultury při vlnové délce 600 nm. Ze získaných výsledků vyplývá, že protein IFI16 má různý vliv na trans-aktivační potenciál nádorového supresoru p53 v závislosti na vazbě k vznikajícím strukturám v blízkosti promotoru genu, a že k úspěšnému vytvoření G-kvadruplexu bylo třeba dosáhnout prahové hodnoty G4Hunteru skóre alespoň 1,591 a zohlednit potenciál dané sekvence formovat úspěšně alespoň 2 G-tetrády.
|
|
|
Influence of cultivation conditions on the production of recombinant proteins
Gardošová, Zuzana ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Recombinant proteins are produced by using genetic modifications. In this process is insert contained gene encoding a certain protein in a cloning vector cloned into the host organism. Recombinant proteins are expressed after the transformation of the cloning vector into a host, the host organism. The expression of recombinant proteins in bacterial cells is one of the most efficient ways to manufacture these proteins. The p53 protein is a tumor suppressor protein, the main role in cells is to react on DNA damage. Due to the reaction to various intracellular and extracellular stimuli, including DNA damage, the p53 protein shows different biological functions, including regulation of senescence, cell cycle, or apoptosis. The theoretical part of the thesis part presents the basic properties of proteins, methods of recombinant protein expression, methods of protein isolation, and characterization of p53 protein. The aim of the experimental part was to determine the effect of incubation temperature on recombinant p53 protein production. The work involves the isolation of plasmid DNA and its transformation into E. coli production cells. The produced proteins were successfully isolated and subsequently characterized by SDS-PAGE and Western Blotting.
|
|
|
Bioinformatické analýzy lokálních struktur DNA u vybraných patogenů
Dobrovolná, Michaela ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Onemocnění způsobená parazitickými červy jsou velmi rozšířená u lidí v rozvojových zemích. Podle WHO jsou parazity celosvětově infikovány přibližně 2 miliardy lidí. Etiologickými činiteli parazitických infekcí jsou zejména parazité kmene Nematoda (hlístice) a Platyhelminthes (ploštěnci) vyvolávající reakce imunitního systému, způsobující podvýživu a chudokrevnost, které jsou primární příčinou úmrtí. Vzrůstající rezistence parazitů na lidská anthelmintika je urychlována jejich nadužíváním, špatnou prevencí a kontrolou infekce. Terapeutický potenciál malých molekulových G4 ligandů byl demonstrován například při stabilizaci struktur G-kvadruplexů, anebo eliminaci patogenů rezistentních na léky. G-kvadruplexy jsou typem sekundární struktury nukleových kyselin tvořené v oblastech bohatých na guanin se schopností regulovat proces genové exprese, opravy poškozené DNA nebo transkripce a translace v onkogenech. K identifikaci a porovnání sekvencí potenciálně tvořících G-kvadruplex (PQS) v jaderných a mitochondriálních genomech šesti zástupců kmene Platyhelminthes a čtyř zástupců kmene Nematoda (které by mohly ukázat vhodná cílová místa pro navázání G4 ligandů sloužící k predikci nových míst účinků léčiv a pomoci při vývoji efektivnějších léčiv) byl požit webový nástroj G4Hunter. Byla potvrzena nenáhodná distribuce PQS v genomu a mtDNA analyzovaných organismů. Nejvíce G-kvadruplexů bylo lokalizováno v těsné blízkosti genů, což naznačuje jejich roli v genové regulaci. Zajímavé je, že v méně infekčních zástupcích kmene Platyhelminthes bylo nalezeno více PQS v porovnání s více infekčními zástupci téhož kmene. Naproti tomu byla u organismu Ascaris lumbricoides spadajícího do kmene Nematoda dokázána přítomnost vysoce stabilních PQS. Tento vysoce patogenní druh je schopen tolerovat velmi stabilní G4, které nejsou u srovnávacího organismu Caenorhabditis elegans téměř vůbec přítomny.
|
|
|
Využití metody PCR pro identifikaci probiotických baktérií v mléčných potravinových výrobcích
Klaška, Dominik ; Brázda, Václav (oponent) ; Smetana, Jan (vedoucí práce)
V rámci práce byla izolována DNA z komerčně dostupného bílého jogurtu. Izolovaná DNA, která byla získána dvěma rozdílnými metodami, byla pomocí spektrofotometru podrobena analýze. Obě metody poskytly dostatečně koncentrovanou i kvalitní DNA pro další analýzu pomocí PCR. Přesně dané úseky izolované DNA byly využitím specifických primerů amplifikovány. Prostřednictvím gelové elektroforézy byla dokázána přítomnost domény Bacteria a při rodově specifické amplifikace také přítomnost bakterií rodu Lactobacillus.
|
|
|
Analýza lokálních struktur v molekulách DNA
Nyczová, Adéla ; Smetana, Jan (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Lokální struktury DNA jsou alternativními konformacemi, které dokáže DNA zaujímat oproti nejběžnější konformaci B-DNA. Tyto struktury hrají často zásadní roli v regulaci základních biologických procesů, jako je replikace DNA, transkripce či vazba specifických ligandů. Díky tomuto biologickému významu jsou alternativní sekundární struktury DNA potenciálním cílem řady léčiv. V této diplomové práci jsou pomocí bioinformatických nástrojů analyzovány lokální struktury v genomech virů z čeledí Flaviviridae a Retroviridae a následně jsou tyto struktury zobrazeny pomocí atomové silové mikroskopie.
|
host ::
RSS.