|
|
Polyfosfáty v jednobuněčných řasách: sledování jejich hromadění a vnitrobuněční lokalizace pomocí Ramanovy mikroskopie
Suja, Matyáš ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Kočišová, Eva (oponent)
Fosfor se hojně využívá v zemědělství, neboť podporuje růst pěstovaných plodin a zvyšuje tak výnosnost půdy. S rostoucí světovou populací se ale dramaticky zvyšuje spotřeba tohoto prvku, přičemž jeho světová naleziště jsou konečná a očekává se jejich vypotřebování v následujících několika desetiletích. Je proto důležité nalézt efektivní způsob recyklace fosforu, který by v budoucnu mohly představovat právě jednobuněčné mikroskopické řasy. Řasy jsou totiž schopné z okolního prostředí vstřebávat nadměrná množství fosforu, který ukládají mimo jiné ve formě polyfosfátů. Polyfosfáty jsou vysokoenergetické biomolekuly, které se vyskytují v buňkách rostlinné i živočišné říše, kde hrají klíčovou roli v řadě životně důležitých procesů. Pro studium metabolizmu a distribuce polyfosfátů na buněčné úrovni lze použít Ramanovu mikroskopii, která umožňuje efektivní analýzu živých buněk bez nutnosti jejich speciálních úprav před měřením. Předmětem této bakalářské práce byl rozvoj metodologie potřebné pro studium akumulace polyfosfátů a jejich vnitrobuněční lokalizace v mikroskopických řasách pomocí Ramanovy mikroskopie.
|
|
|
Studium struktury guaninových kvadruplexů pomocí neresonanční Ramanovy spektroskopie
Golan, Martin ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Mašek, Vlastimil (oponent)
Úseky lidských telomerových sekvencí obsahující alespoň 4 guaninové subsekvence jsou schopny formovat konformačně variabilní intrastrandové kvadruplexy. Dřívější studie využívající konvenční Ramanovu spektroskopii uvádí, že sekvence G3(TTAG3)3 o milimolárních koncentracích ve fosfátovém pufru s přidanými ionty Na+ o iontové síle 150 mM zaujme antiparalelní konformaci bez ohledu na délku stání vzorku či jeho annealing, kdežto ionty K+ vedou k postupnému přechodu do "3+1", případně paralelní konformace. Výsledky měření sekvence AG3(TTAG3)3 taktéž o milimolárních koncentracích pomocí tzv. Photonic Crystal Fibre-enhanced Raman Spectroscopy (PCFRS) naopak udávají, že v přítomnosti sodíku i v přítomnosti draslíku (iontová síla roztoků 100 mM) se po dvoudenním stání vytvoří struktura paralelní. Tato práce zkoumá sekvenci AG3(TTAG3)3 metodami konvenční Ramanovy spektroskopie a Ramanovy spektroskopie kapkově nanášených povlaků v rozsahu koncentrací od jednotek do stovek milimolů v oligodeoxyribonukleotidech. Dochází k závěru, že struktura ve fosfátovém pufru s ionty Na+ je antiparalelní i navzdory dlouhému stání a annealingu, kdežto v přítomnosti draselných iontů je a zůstane v konformaci "3+1". Byly navrženy dvě hypotézy o příčině rozdílů mezi výsledky získanými pomocí PCFRS a konvenční Ramanovy spektroskopie:...
|
|
|
Ramanova mikrospektroskopie a mapování jednotlivých buněk
Gregorová, Šárka ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Plášek, Jaromír (oponent)
Ramanova mikrospektroskopie umožňuje měřit spektra Ramanova rozptylu s prostorovým rozlišením v řádu μm3 a studovat tak neinvazivním způsobem přirozené složení biologických objektů jako jsou tkáně, jednotlivé buňky a buněčné organely. V předkládané práci byly pomocí Ramanovy mikrospektroskopie studovány vakuoly oportunisticky patogenní kvasinky druhu Candida albicans. Byly naměřeny rozsáhlé série Ramanových spekter vakuol při různých způsobech kultivace buněk. K vyhodnocení souborů Ramanových spekter byla využita vícerozměrná statistická metoda rozkladu do singulárních hodnot (singular value decomposition). Spektrální analýza umožnila charakterizaci chemického složení vakuol. Bylo zjištěno, že vakuoly buněk kultivovaných různým způsobem či v různých kultivačních médiích se mezi sebou liší zejména obsahem polyfosfátu, reprezentovaného ve spektru úzkým pásem s maximem okolo 1155 cm-1 . Až o několik cm-1 se může překvapivě lišit též poloha maxima tohoto pásu na vlnočtové škále. Na základě experimentů provedených in vitro s hexametafosfátem sodným coby modelem vakuolárního polyfosfátu bylo navrženo, že poloha maxima tohoto pásu je významně ovlivněna koncentrací dvojmocných kationtů.
|
|
|
Biologically important non-canonical structures of nucleic acids in complexes with cationic porphyrins
Palacký, Jan ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Setnička, Vladimír (oponent) ; Víglaský, Viktor (oponent)
Guaninové kvadruplexy tvoří třídu neobvyklých konformací nukleových kyselin založených na stohování guaninových tetrád stabilizovaných prostřednictvím Hoogsteenovského párování a koordinace kationtů. Podílejí se celé řadě buněčných procesů včetně replikace, rekombinace nebo transkripce. Guaninové kvadruplexy jsou velmi rozšířené v lidském genomu, ale nejvíce se vyskytují v jednovláknových oblastech telomer bohatých na guanin. O telomerní guaninové kvadruplexy roste zájem díky jejich schopnosti inhibovat aktivitu enzymu telomeráza, který je zodpovědný za proliferaci nádorových buněk. Konkrétně jsme zkoumali konformační polymorfismus základní lidské telomerní sekvence G3(TTAG3)3 vyvolaný koncentrací DNA, kovových kationtů (K+ , Na+ ) a/nebo teplotní renaturací. Ramanova spektroskopie byla použita jako primární metoda pro toto studium, neboť, na rozdíl od běžných spektroskopických metod, jsme mohli sledovat strukturu kvadruplexu za velmi vysokých koncentrací DNA napodobujících podmínky molekulárního shlukování v buňce. Ukazujeme, že kvadruplex G3(TTAG3)3 přechází mezi antiparalelním a paralelním uspořádáním řetězců v závislosti na koncentraci DNA a iontů K+ . Kromě toho také ukazujeme, že kationické porfyriny mohou sloužit jako citlivé sondy konformace kvadruplexů. Závěrem diskutujeme možnou dimerizaci...
|
|
|
Studium nukleových kyselin a jejich interakcí pomocí Ramanovy mikrospektroskopie kapkově nanášených povlaků (DCDR)
Souček, Pavel ; Kopecký, Vladimír (vedoucí práce) ; Mojzeš, Peter (oponent)
Práce je zaměřena na možnosti využití nové techniky nerezonanční Ramanovy spektroskopie - Ramanovy spektroskopie kapkově nanášených povlaků (drop coating deposition Raman - DCDR) při studiu nukleových kyselin. DCDR spektroskopie je založena na depozici malé kapky roztoku studované látky na hydrofobní povrch, kde po odpaření rozpouštědla, vznikne kroužek látky ve skelné fázi. Tak dojde k zakoncentrování látky a při měření pomocí Ramanova mikrospektrometru i k několika řádovému zvýšení signálu oproti standardní technice měření vzorků v kapalné fázi. V práci jsme studovali chování 12-merů DNA a DNA o délce 3000 párů bází. Náš výzkum ukázal, že DCDR spektra DNA rozpuštěné v deionizované vodě lze měřit až do koncentrace 30 M na bázi. DCDR Spektra jsou blízká spektrům měřeným z kapalné fáze, avšak deponovaný vzorek nikdy nevytváří kroužek. Ukázalo se, že dominantní roli při vzniku kroužku u nukleových kyselin hraje nikoli velikost molekul, ale jejich náboj, který vede k vzájemnému odpuzování molekul. Po přidání iontů sodíku a následně též iontů hořčíku byl pozorován vznik prstence. Faktorová analýza spektrálních map ale ukázala, že vzniklé prstence DNA nejsou spektrálně zcela homogenní a při jejich vzniku může hrát roli např. kondenzace DNA.
|
|
|
Ramanova mikrospektroskopie na mikrofluidních zařízeních
Peksa, Vlastimil ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Šloufová, Ivana (oponent)
Miniaturizace zařízení pro studium chemických interakcí a procesů v kapalných vzorcích vedla ke vzniku mikrofluidiky a konstrukci tzv. lab-on-a-chip systémů. Náplní této práce byla implementace, rozvoj a testování mikrofluidních zařízení s detekcí pomocí konfokální Ramanovy mikroskopie a povrchem zesíleného Ramanova rozptylu v podmínkách školícího pracoviště. Byly testovány možnosti přenesení některých typů běžných makroskopických měření do mikroskopických podmínek. Byla navržena a odzkoušena metoda měření teplotní stability biopolymerů s bezkontaktní detekcí teploty v mikrosystémech. Rovněž byly studovány možnosti využití mikrofluidních zařízení pro studium SERS efektu. Bylo demonstrováno, že mikrofluidní čipy poskytují perspektivní možnost studia hydrodynamiky kapalin na mikroskopické úrovni a chemických reakcí a kinetik.
|
|
|
Intenzitní normalizace Ramanových spekter pomocí různých vnitřních standardů
Sláma, Vladislav ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Procházka, Marek (oponent)
Práce se zabývá testováním vybraných anorganických aniontů jako vnitřních standardů pro intenzitní normalizaci Ramanových spekter. Na koncentračních řadách a teplotních posloupnostech vodních roztoků PO4 3- , (CH3)2AsO2-, NO3- a SO4 2- studuje vliv spektrálních změn pásů standardů na spolehlivost a přesnost intenzitní kalibrace. Teplotní a koncentrační série spekter aniontů jsou dále využity pro testování intenzitní normalizace pomocí pásů valenčních a deformačních vibrací vody. Kromě toho je testována spolehlivost a robustnost kalibračních postupů využívajících různé spektrální parametry obsažené v Ramanových spektrech standardů. Výsledky práce odkrývají možné zdroje artefaktů a interpretačních chyb, které plynou z nedostatečné znalosti chování se standardů vlivem měnících se fyzikálně- chemických parametrů, případně nevhodným kalibračním postupem.
|
|
|
Studium komplexů kationických porfyrinů s nukleovými kyselinami pomocí spektroskopie povrchem zesíleného resonančního Ramanova rozptylu
Lásková, Barbora ; Mojzeš, Peter (vedoucí práce) ; Michl, Martin (oponent)
Komplexy kationických porfyrinů s nukleovými kyselinami jsou zajímavé z hlediska transportu terapeutických oligonukleotidů do buněk nebo fotodynamické terapie nádorových onemocnění. Diplomová práce se zabývá studiem komplexů kationického metaloporfyrinu CuTMPyP4 s poly(dG-dC)2, kde je předpokládána interkalace porfyrinu mezi bázové páry polynukleotidu a s poly(dA-dT)2, poly(dA)·poly(dT), u kterých je usuzováno na vnější vazbu CuTMPyP4 k helixu. Měření byla prováděna pomocí SERRS, RRS a absorpční spektroskopie. Z časových vývojů SERRS spekter pro jednotlivé komplexy bylo zjištěno, že velikost intenzity SERRS spekter a rychlost SERRS kinetik z komplexů neodpovídá intuitivnímu předpokladu o nízkém SERRS signálu a jeho pomalém nárůstu v případě interkalace porfyrinu, neboť pro komplex CuTMPyP4 s poly(dG-dC)2 je průběh SERRS kinetiky velmi rychlý a výsledný SERRS signál mnohem větší, než pro poly(dA-dT)2, poly(dA)·poly(dT). Po porovnání výsledků ze SERRS a RRS se ukázalo, že při SERRS experimentech je pozorované spektrum důsledkem spíše než porfyrinu v komplexu důsledkem porfyrinu z komplexu uvolněného. Při charakterizaci koloidních systémů pro SERRS měření bylo dále zjištěno, že pro koloidy s nízkým -potenciálem je SERRS signál nestabilní s dobou expozice vzorku, což je patrně způsobeno projevem tvorby "hot...
|
|
| |
|
| |
host ::
RSS.