|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Study of function and molecular architecture of fungal nitrilases applicable in biocatalysis
Veselá, Alicja Barbara ; Martínková, Ludmila (vedoucí práce) ; Macek, Tomáš (oponent) ; Teisinger, Jan (oponent)
Nitrilasy jsou enzymy katalyzující hydrolýzu nitrilů na příslušné karboxylové kyseliny a amonné ionty. Tyto enzymy mohou nalézt využití v biokatalýze a bioremediaci pro vyšší nenáročnost, bezpečnost a jednoduchost takto katalyzovaných reakcí před konvenčními metodami hydrolýzy nitrilů. V této práci byly pomocí metody prohledávání databazí vybrány sekvence hypotetických fungálních nitrilas. Jako templáty posloužily aminokyselinové sekvence fungálních nitrilas již dříve charakterizovaných v naší laboratoři. Následně byly nové syntetické geny spolu se zbylými geny z naší nitrilasové knihovny exprimovány v E. coli a poté byly porovnány jejich substrátové specifity a podobnost sekvencí. Arylacetonitrilasy z hub Arthroderma benhamiae (NitAb) a Nectria haematococca (NitNh) byly purifikovány a charakterizovány; byly stanoveny jejich substrátové specifity, kinetické parametry, pH a teplotní profily a velikost podjednotek. NitAb a NitNh spolu s dalšími rekombinantními fungálními nitrilasami byly použity pro hydrolýzu vysokých koncentrací (R,S)-mandelonitrilu v jedné dávce nebo s postupným dávkováním substrátu. Ze studovaných enzymů nitrilasa z Aspergillus niger vykázala nejlepší enantioselektivitu (e.e. pro (R)-mandlovou kyselinu až 97,6 %) a produktivitu enzymu v sušině (až 40 g gsuš -1 ). NitAb byla pouze mírně...
|
|
|
Structure and biocatalytic properties of nitrilases from filamentous fungi
Křenková, Alena ; Martínková, Ludmila (vedoucí práce) ; Macek, Tomáš (oponent) ; Klempier, Norbert (oponent)
Vláknité houby jsou vedle bakterií bohatým zdrojem nitrilas využitelných pro biotechnologické účely. V databázích lze najít velké množství sekvencí domnělých nitrilas, ale jen málo těchto enzymů bylo exprimováno, purifikováno a charakterizováno. Syntetické geny nitrilas z Aspergillus niger CBS 513.88 a Neurospora crassa OR74A byly navrženy podle sekvencí uložených v databázi GenBank. Tyto geny byly exprimovány v Escherichia coli a získané nitrilasy byly purifikovány a charakterizovány. Také byla studována ko-exprese molekulárních chaperonů s nitrilasami pomocí sady komerčních chaperonových plasmidů. Pro studium strukturních vlastností nitrilas byly použity různé metody, jako je homologní modelování, analytická ultracentrifugace nebo elektronová mikroskopie. Produkce rekombinantních nitrilas byla srovnána s produkcí nativními producenty - vláknitými houbami. Vzhledem k nízké produkci enzymu těmito houbami a jejich obtížné kultivaci se ukázalo být výhodným využití prokaryotického expresního systému. Vliv aminokyselin v blízkosti katalytického cysteinu na aktivitu, chemoselektivitu a enantioselektivitu byl studován pomocí bodových mutací. Vliv určitých aminokyselin v blízkosti katalytického centra enzymu na jeho vlastnosti je podobný i u vzdáleně příbuzných nitrilas, proto je možné katalytické...
|
|
| |
|
|
Nitrile hydrolysing enzymes: Fungal nitrilases
Vejvoda, Vojtěch ; Martínková, Ludmila (vedoucí práce) ; Wimmer, Zdeněk (oponent) ; Vosáhlová, Simona (oponent)
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Biochemistry A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy Nitrile-hydrolysing enzymes: Fungal nitrilases Mgr. Vojtěch Vejvoda Supervisor: Ing. Ludmila Martínková, CSc. Laboratory of Biotransformation, Institute of Microbiology, v.v.i. Academy of Sciences of the Czech Republic Consultant: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DrSc. Faculty of Science, Department of Biochemistry, , Charles University in Prague Prague 2010 ÚVOD Nitrily jsou v přírodě všudypřítomné, nejen jako přírodní látky tvořené rostlinami, ale i jako sekundární metabolity mikroorganismů a vyšších organismů. Umělé nitrily a anorganické kyanidy se vyskytují v prostředí jako znečištění způsobené člověkem (průmyslové odpady, herbicidy, atd.). Přírodní i umělé nitrily jsou pro mnohé organismy jedovaté. Přírodní nitrily slouží jako obrana proti nepřátelům (např. pro rostliny to jsou býložravci), umělé nitrily jako herbicidy. Jakkoliv tyto sloučeniny negativně ovlivňují živé organismy ve svém okolí, tvoří také evoluční tlak, který pravděpodobně vede k tvorbě enzymů katalyzujících jejich odbourávání, a co více, i k jejich využití jako zdroje energie. Enzymy hydrolyzující nitrily jsou mezi organismy poměrně vzácné. Vyskytují se v určitých čeledích prokaryot (nitrilasy,...
|
host ::
RSS.