|
|
Interakce nízkoteplotního plazmatu za atmosférického tlaku (CAPP) s nepatogenními bakteriemi
Chobotská, Barbora ; Brázda, Václav (oponent) ; Kozáková, Zdenka (vedoucí práce)
Předmětem této bakalářské práce je studium dekontaminačních vlastností nízkoteplotního plazmatu generovaného za atmosférického tlaku na vybrané bakterie Escherichia coli a Staphylococcus epidermidis. Bylo použito nízkoteplotní mikrovlnné plazma s pochodňovým výbojem. Plazmová tryska byla propojena se softwarem v počítači, díky čemuž mohlo docházet k jejímu pohybu po ošetřované ploše. Byl použit výkon, který kolísal mezi 12–13 W, a jako pracovní plyn byl zvolen argon (čistota plynu 4,6) s konstantním průtokem 5 l/min. Byl pozorován úbytek jednotlivých kolonií v závislosti na zvoleném parametru ošetření. Mezi zvolené parametry ošetření patřil vliv rychlosti, směru a doby ošetření u obou studovaných bakterií. Cílem bylo dosáhnout co nejvyšší dekontaminace ošetřované plochy a zjistit, jaký z těchto parametrů je nejvýznamnější. Bylo zjištěno, že mezi jednotlivými směry ošetření není viditelný rozdíl v celkové dekontaminaci ošetřované plochy u studované bakterie Escherichia coli. Negativní vliv rychlosti byl zaznamenán pouze u nejrychlejší použité rychlosti v případě grampozitivní bakterie Staphylococcus epidermidis. Nejvýznamnějším parametrem byl čas ošetření, kdy byl pozorován výrazný úbytek nárůstu kolonií se zvyšujícím se časem daného ošetření. Dále bylo provedeno opakované ošetření, kdy z již ošetřených bakterií bylo znovu nachystáno inokulum a bylo pozorováno, zda nevzniká rezistence vůči ošetření nízkoteplotním plazmatem. Z výsledků je patrné, že nedochází k výraznému nárůstu kolonií ani po znovu opakovaném ošetření. Dále bylo pozorováno, že u grampozitivní bakterie Staphylococcus epidermidis dochází k menšímu úbytku kolonií nežli u gramnegativní bakterie Escherichia coli ve všech studovaných parametrech ošetření.
|
|
|
Izolace a charakterizace protilátek specifických k DNA struktuře kvadruplexu
Oršel, Jiří ; Stříž, Radim (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se věnuje izolaci tří protilátek vázajících guaninové kvadruplexy (G-kvadruplexy) a jejich charakterizaci prostřednictvím SDS-PAGE, westernového přenosu s následnou imunodetekcí a elektroforetických testů posunu mobility k vyhodnocení specifity vazby ke kvadruplexové DNA. G kvadruplexy jsou nekanonické sekundární struktury DNA vznikající v oblastech bohatých na guanin, jako jsou například telomery, či promotory některých onkogenů, kde plní regulační funkce a mohou se podílet na vzniku nádorových onemocnění. V první části této práce byly protilátky BG4, SG4 a její mutant SG4 R105A izolovány z bakteriálního expresního systému E. coli BL21 DE3, načež byla stanovena jejich koncentrace v získaných kontrolách a elucích metodou podle Bradfordové. Čistota získaných elucí byla potvrzena SDS-PAGE a westernovým přenosem s následnou imunodetekcí. V druhé části této práce byly vazebné vlastnosti izolovaných proteinů analyzovány metodou elektroforetických testů posunu mobility. Výsledky vazebných experimentů prokázaly vysokou specifitu proteinu SG4 ke G-kvadruplexům, obzvláště v nízkých molárních poměrech DNA:protein (1:5). Oproti tomu protilátka BG4 vykazovala horší specifitu vůči G-kvadruplexové DNA. Při vyšších koncentracích protein BG4 vykazoval stejnou preferenci vazby ke dvouřetezcové DNA jako ke struktuře G-kvadruplexu. Rozdíl afinity BG4 ke G-kvadruplexové a dvouřetězcové DNA se pohyboval v rámci stanovené experimentální chyby. Protilátka SG4 R105, která byla vytvořena jako mutantní protein SG4 bez preference k vazbě G-kvadruplexů překvapivě vázala jednořetězcovou i G-kvadruplexovou DNA.
|
|
|
Porovnání mikrobiálního složení anglického sýru Blue Stilton s příbuznými sýry
Druláková, Tereza ; Vodička, Juraj (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářské práce se zabývá problematikou porovnání anglického sýru s modrou plísní Blue Stiltonu s běžně dostupnými sýry stejného druhu Roquefortem a Nivou, a to z hlediska mikrobiálního složení, obsahu aromatických těkavých látek a také pomocí senzorické analýzy. Těmito metodami je drahý sýr Blue Stilton odlišen od běžných a levnějších sýrů stejného druhu v rámci České republiky. Metodou RT-PCR byla prověřována přítomnost 15 vybraných druhů mikroorganismů. Pro Blue Stilton se ukázaly být specifické 3 z nich, konkrétně bakterie Brevibacterium linens a kvasinky Geotrichum candidum a Kluyveromyces lactis. Aromatické těkavé látky byly stanoveny metodou HS-SPME-GC-MS. Na aromatickém profilu všech sýrů se nejvíce podílely látky heptan-2-on, nonan-2-on, non-8-en-2-on a kyseliny hexanová a oktanová. Sýry je možné rozlišit na základě podílu těchto látek na jejich aromatickém profilu nebo také dle množství těchto látek v jednotlivých vzorcích. Provedené senzorické hodnocení odhalilo, že ve většině parametrů jako je vzhled, konzistence a chuť je pro české spotřebitele nejpřijatelnější sýr Niva, v kategorii vůně byl naopak nejoblíbenější Blue Stilton. Na základě získaných dat dokážeme díky specifickým mikroorganismům a jedinečnému aromatickému profilu rozlišit Blue Stilton od ostatních sýrů s modrou plísní.
|
|
|
Lokální struktury v genomech retrovirů
Sádlová, Adéla ; Kollerová, Silvia (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zaměřuje na studium lokálních struktur v genomech retrovirů. Retroviry jsou skupinou virů s RNA genomem, které mají schopnost integrovat svůj genom do hostitelské DNA. Lokální struktury v genomu retrovirů hrají důležitou roli v procesech replikace, regulace genové exprese a interakcí s hostitelskými proteiny. Cílem této práce bylo analyzovat lokální struktury u vybraných retrovirů pomocí bioinformatických metod, přičemž klíčovým nástrojem byl G4 hunter, což je nástroj pro identifikaci G-kvadruplexů v genomu. G kvadruplexy jsou struktury DNA nebo RNA, které se skládají z guaninových základů uspořádaných do čtveřic a jsou spojeny vrstvením guaninových tetrád. G kvadruplexy jsou často lokalizovány v telomerách a promočních oblastech genů, a mohou hrát důležitou roli v regulaci genové exprese, replikaci DNA a dalších buněčných procesech Analýza se zaměřila především na přítomnost potenciálních sekvencí tvořící G-kvadruplexy (PQS). Výsledky této práce poskytují důležité informace o distribuci a frekvenci PQS v genomech vybraných retrovirů a přispívají k lepšímu porozumění jejich role v biologii virů. Výsledky ukazují, že G-kvadruplexy jsou významné lokální struktury a často se nacházejí v regulačních oblastech genomu, což naznačuje jejich klíčovou roli v procesu virové infekce.
|
|
|
Evaluace přítomnosti probiotických bakterií v potravinovém doplňku pomocí molekulárně biologických metod
Dvornyi, Nikolai ; Brázda, Václav (oponent) ; Smetana, Jan (vedoucí práce)
Probiotika jsou prospěšné mikroorganismy, které při správném podávání schopny přinášet hostiteli zdravotní benefity, například podporu trávení a posílení imunitního systému. Jejich účinnost a přínosy závisí na konkrétním kmenu mikroorganismu. Proto je velmi důležitě mít metody rychlé a spolehlivé pro identifikaci MO. Tyto kmeny jsou často z rodů Lactobacillus, Bifidobacterium, a představují přirozené hostiteli gastrointestinálního traktu. Tato bakalářská práce se zaměřuje na identifikaci probiotických bakterií v komerčně dostupném doplňku stravy Linex® Forte pomocí molekulárně biologických metod, především polymerázové řetězové reakce (PCR). Cílem bylo ověřit přítomnost deklarovaných probiotických kultur Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium animalis, a porovnat výsledky s údaji uvedenými výrobcem. K tímto účelům byly použity dvě metody izolace DNA: fenolchloroformová extrakce a komerční purifikační kit OMNI International. Následně byla izolovaná DNA analyzována pomocí doménově, rodově a druhově specifické PCR. Výsledky ukazují, že použité metody jsou vhodné pro identifikaci probiotických bakterií a potvrzují jejich přítomnost ve vybraném výrobku.
|
|
|
Vliv výrobního prostředí na výskyt kontaminující plísně typu Penicillium u sýrů zrajících pod mazem
Veselá, Vendula ; Brázda, Václav (oponent) ; Vítová, Eva (vedoucí práce)
Tématem této diplomové práce je monitoring prostředí výrobního závodu na výrobu sýrů zrajících pod mazem se zaměřením na výskyt plísně typu Penicillium jako hlavního kontaminujícího mikroorganismu. Během celého výrobního procesu byly odebírány vzorky ovzduší ve výrobním závodě metodou spadu na vytipovaných 21 místech. Pomocí kultivačních (dle ČSN norem), mikroskopických a molekulárně diagnostických technik byl u odebraných vzorků sledován celkový počet mikroorganismů, vybrané skupiny mikroorganismů a cílový mikroorganismus (plísně rodu Penicillium). Cílem bylo zhodnotit výskyt druhů Penicillium citrinum, chrysogenum a commune v závislosti na místě odběru vzorku a času výroby. V rámci screeningu výroby byla nejprve hodnocena širší mikroflóra a až posléze byl sledován výskyt kontaminujících plísní. Pomocí makroskopických a mikroskopických metod, bylo vybráno 36 morfologicky rozdílných kolonií. Mikroskopicky byla prokázána přítomnost bakterií, kvasinek a plísní rodu Penicillium, Cladosporium a Aspergillus. Za účelem identifikace vyskytujících se mikroorganismů byla provedena analýza pomocí metody polymerázové řetězové reakce, čemuž předcházela izolace DNA pomocí NucleoSpin Microbial DNA kitu a pomocí fenolové extrakce. Na základě výsledků pozorování potvrzených polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase, byl zjištěn výskyt kontaminující plísně rodu Penicillium i Cladosporium již v počátku výroby. Plísně těchto rodů se vyskytují napříč celým provozem kromě jediné místnosti, která slouží jako chladírna tvarohu před formováním. Rod Aspergillus v podobě žluté plísně s bílým myceliem na okraji kolonie byl zachycen pouze jednou v sušárně, kde dochází ke zrání sýrů, a prokázán mikroskopickým pozorováním. Rod Cladosporium byl ve výrobním prostředí zachycen v pěti morfologicky odlišných formách. Rod Penicillium byl reprezentován 13 morfologicky rozdílnými koloniemi, polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase byla prokázána přítomnost Penicillium commune, Penicillium chrysogenum. Kromě uvedených plísní bylo zachyceno 11 morfologicky rozdílně se projevujících bakterií, z nichž byla izolována DNA. Polymerázovou reakcí v reálném čase byla tato DNA prokázána jako DNA koryneforem, u čtyř z nich se jednalo o DNA rodu Brevibacterium. Výsledky této práce kompletně mapují kontaminaci výrobního prostředí závodu, na jejich základě byly navrženy způsoby sanitace prostředí pro zajištění dekontaminace výrobního procesu.
|
|
|
Vliv makroelementů z potravy na DNA a epigenetický profil
Veselý, Zdeněk ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Makroelementy obsažené v potravě mají důležitou funkci pro lidský organismus. Podílí se na řadě biochemických reakcí v lidském těle a jejich vyvážené množství je důležité pro prevenci vážných onemocnění. V teoretické části bakalářské práce byla popsána funkce minerálních látek v lidském organismu, funkce DNA a epigenetických mechanismů, jako je metylace DNA nebo modifikace histonů. Byl popsán vliv výživy a funkce vybraných makroelementů – sodík, hořčík, vápník, draslík na epigenetické modifikace a na stabilitu G-kvadruplexů. Cílem experimentální části práce bylo studovat vliv těchto látek na DNA struktury in vitro a připravit experimentálně pro studium in vivo.
|
|
|
Vliv skladování na mikrobiální složení francouzského sýru Saint-nectaire
Šislerová, Lucie ; Mikulíková, Renata (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Předmětem mé práce je porovnání mikrobiálního složení mezi farmářským a mlékárenským typem sýru Saint-nectaire a vliv doby a teploty skladování na vývoj mikrobiálního složení, obsah mastných kyselin a aromatických látek. Pomocí RT-PCR byly identifikovány vybrané mikroorganismy. U farmářského typu Saint-nectaire byly oproti mlékárenskému typu navíc identifikovány Penicillium roqueforti a fuscoglaucum. U obou typů sýru bylo detekováno nejvyšší množství vybraných mikroorganismů u sýru čerstvého. Při skladování při 20 °C se objevil nárůst oproti sýru čerstvému u těchto mikroorganismů: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Cladosporium herbarum a Penicillium commune a camemberti, a dále byla zaznamenána přítomnost kontaminantů a patogenních organismů. Po týdnu skladování při 20 °C šlo o Micrococcus luteus, Salmonella enterica a Staphylococcus aureus a po dalších dvou týdnech skladování byla navíc identifikována Listeria monocytogenes. Obsah mastných kyselin a těkavých látek byl porovnán u pěti vzorků: sýr čerstvý, sýr skladovaný v lednici po dobu jednoho týdne a tří týdnů a sýr skladovaný při 20 °C po dobu jednoho týdne a tří týdnů. Byl změřen obsah vázaných a volných mastných kyselin, obojí pomocí GC-FID. Obsah vázaných mastných kyselin byl srovnatelný u všech měřených vzorků. Nejvyšší obsah volných mastných kyselin byl u sýru po třech týdnech skladování při 20 °C. Nejvíce zastoupenou mastnou kyselinou je kyselina palmitová. Těkavé látky byly stanoveny pomocí metody HS-SPME-GC-MS. Nejvíce těkavých látek bylo identifikováno v sýru po třech týdnech při 20 °C a v sýru po týdnu v lednici. Nejvíce zastoupenými skupinami byly alkoholy, ketony a kyseliny.
|
|
|
Příprava konstruktů pro izolaci proteinů a jejich testování
Osadchuk, Olha ; Kostovová, Iveta (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce je zaměřená na popis produkce rekombinantních proteinu. Pro studium dané problematiky byl zvolen protein p53, který je jedním z hlavních nádorových supresorových proteinu. Protein p53 je zodpovědný za regulaci mnoha genů, které mohou kontrolovat buněčný cyklus a replikaci DNA, a je nejčastěji mutovaným genem u nádorových onemocněni člověka. Pro danou prací byly zvolený různé varianty bodových mutaci proteinů p53, které mohou ovlivnit jeho vazebné vlastnosti a funkce. Znalosti mechanizmu působení mutovaných p53 proteinů v buňce je důležité pro efektivní léčbu rakoviny. V teoretické části jsou popsaný vlastnosti proteinu a jednotlivé expresní systémy, metody Gateway klonováni, a metody použité při purifikaci a izolaci proteinů (afinitní chromatografie, SDS-PAGE analýza a Western blot analýza). V experimentální časti jsou popsané postupy přípravy expresních vektoru pomoci Gateway technologie, transformace do buněk a izolace plazmidové DNA. Klonováním byly připraveny tři expresních klony a po jejich transformace do kompetentních buněk byla provedena izolace DNA.
|
|
|
Využití molekulárních technik k charakterizaci kvasinek rodu Metschnikowia
Schneiderwindová, Nicole ; Brázda, Václav (oponent) ; Němcová, Andrea (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá možnostmi provedení a využití molekulárních metod k charakterizaci kvasinek rodu Metschnikowia a také aplikací metod v biotechnologiích případně v potravinářském průmyslu. V teoretické části je zaměřená na stručný popis kvasinek, zejména vybraných druhů, které se používaly během praktické části, možnosti jejich využití, a především na detailní popis všech použitých molekulárních technik. V praktické části se zaměřuje na optimalizaci použitých molekulárních metod, konkrétně metody pulzní gelové elektroforézy (PFGE) a metody denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE). Na začátku byla provedena kultivace kvasinek za optimálních podmínek, které jsou pro tento rod specifické. Dále byla pomocí izolačních technik izolována jejich DNA, která byla následně podrobena zpracování pomocí metod PFGE a PCR–DGGE. Nejvíce bylo třeba optimalizovat postup izolace DNA. Bylo provedeno několik optimalizací koncentrace lyzačních enzymů, zejména pak enzymu lytikázy. Také bylo potřeba stanovit správný poměr low-melting agarosy a izolované DNA, což bylo zásadní pro správnou konzistenci izolovaných DNA bločků a pro jejich další uplatnění při PFGE analýze. Nakonec byla provedena optimalizace metody PFGE, která přinesla správné rozdělení chromozomů, díky čemuž bylo možné jednotlivé chromozomy popsat dle jejich velikosti podle použitého standardu CHEF kvasinky Hansenula wingei. Pro správnou optimalizaci samotného procesu DGGE analýzy bylo třeba nejdříve izolovat kvasinkovou DNA pomocí kitu, tato DNA byla následně použita jako templát pro PCR reakci. Byla optimalizována také teplota annealingu pro jednotlivé skupiny použitých primerů. Amplikony, které byly získány pomocí této reakce byly separovány pomocí metody DGGE. U této techniky bylo zapotřebí především optimalizace základních parametrů jako je rozsah denaturačního gradientu či celkový čas separace. Dle výsledků měření lze určit, že postup izolace DNA kvasinek a jejich následná analýza pomocí molekulárních metod pulzní gelové elektroforézy a denaturační gradientové gelové elektroforézy byla úspěšná. Podařilo se nám alespoň částečně popsat genom a určit počet chromozomů u všech použitých druhů kvasinek rodu Metschnikowia.
|
host ::
RSS.