Original title:
Využití fluorescenčních technik k analýze průmyslově významných mikroorganismů
Translated title:
Utilisation of fluorescence techniques for analysis of industrially relevant microorganisms
Authors:
Müllerová, Lucie ; Kráčmar, Stanislav (referee) ; Krčma, František (referee) ; Obruča, Stanislav (advisor) Document type: Doctoral theses
Year:
2023
Language:
eng Publisher:
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická Abstract:
[eng][cze]
Techniky analýzy jednotlivých buněk neboli single-cell analýzy, jsou velmi důležité v kontextu studia důležitých biotechnologických mikroorganismů. V biotechnologických procesech je optimální mít rychlé, efektivní a real-time analýzy, které lze provést s minimální přípravou vzorku. Proto jsme v rámci předložené disertační práce využili autofluorescenci jako marker fyziologického stavu mikrobiální kultury, který je možné analyzovat pomocí fluorescenční mikroskopie a/nebo průtokové cytometrie. Nejdříve bylo potvrzeno, na základně emisních spekter, že zelená autofluorescence emitovaná bakteriemi Cupriavidus necator H16 a jejím polyhydroxyalkanoáty (PHA) neprodukujícím mutantem Cupriavidus necator PHB-4, pochází skutečně z flavinů. Emisní maximum bylo naměřeno v rozmezí 510–550 nm pro FAD, FMN a riboflavin – bohužel jednotlivá spektra od sebe nebylo možné rozeznat, a 515 nm pro oba bakteriální kmeny Cupriavidus necator. Byly nalezeny dvě maxima excitačních spekter, jedno v rozmezí 360–370 nm a druhé okolo 440 nm. Z těchto poznatků byl sestaven nový protokol pro fluorescenční mikroskopii – laser byl nastaven na hodnotu 467 nm a emisní filtr pro detekci byl vybrán 520/35 nm. Flaviny a jejich autofluorescence může být take použita v kombinaci s jinými fluorofory, když jsou použity multiparametrické analýzy, ale je důrazně doporučeno, aby vybrané fluorescenční sondy buď emitovaly v jiném rozmezí, než je 500–550 nm anebo byla jejich doba života excitovaného stavu jiná, než je interval 3,2–3,7 a 4,2 – 4,9 ns. Tyto doby života navíc zůstaly konstantní, i když byly buňky vystaveny kultivačním a stresovým podmínkám. To z nich dělá velmi stabilní marker v porovnání s dynamickým charakterem intenzit fluorescence. Dále byl optimalizován protokol pro značení bakterie C. necator s využitím PHA specifické sondy BODIPY 493/503. Optimální koncentrace této lipofilní sondy byla stanovena na 2,5 µg ml-1 a sondu je možné dle našich dat aplikovat společně s viabilitní sondou propidium iodidem. Tento protokol byl také využit pro studium morfologie PHA-syntetizující halofilní bakterie Halomonas halophila. Pro stanovení UV-protektivních vlastností PHA obsaženého v bakterii Cupriavidus necator, byl optimalizován další protokol, tentokrát pro ROS citlivou sondu CM-H2DCFDA, která byla stanovená jako citlivější v porovnání s její nemethylovanou formou. V této studii byly navíc potvrzeny UV-protektivní vlastnosti PHA na bakterii Cupriavidus necator H16 v porovnání s PHA nesyntetizujícím kmenem Cupriavidus necator PHB-4.
Single-cell analysis techniques are very important when studying relevant biotechnological microorganisms. In biotechnological processes, the optimum is to have fast, efficient and real-time analyses that can be done with minimal preparations. Therefore, we looked at autofluorescence as a possible and natural marker when employing fluorescence microscopy and flow cytometry. First, it has been established, based on the emission spectra, that the green autofluorescence of the bacteria used – Cupriavidus necator H16 and its non polyhydroxyalkanoates (PHA) producing mutant Cupriavidus necator PHB-4, is caused predominantly by flavins. The maxima of emission spectra were 510 – 550 nm for FAD, FMN and riboflavin whose spectra could not be distinguished, and 515 nm for both strains of Cupriavidus necator. Two maxima of excitation spectra of the bacteria were found – one in the range 360 – 370 nm and another around 440 nm, and so a new protocol for fluorescence microscopy has been established - the laser used was 467 nm and the emission filter chosen for the detection was 520/35 nm. Flavins and their autofluorescence can also be used in combination with other fluorophores when the need for multi-parametrical analyses arises, but it’s highly recommended the other dyes emit other than green fluorescence in the band of 500 – 550 nm or/and have an average fluorescence lifetime other than 3.2 – 3.7 and 4.2 - 4.9 ns. These values stayed constant even when the cells were exposed to various cultivation and even stress conditions. That makes them a very stable marker compared to the dynamic marker of fluorescence intensity that changes immediately after a change in the environment. A new staining protocol for C. necator using PHA-specific hydrophobic probe BODIPY 493/503 was optimised. The optimal staining concentration of the lipophilic dye BODIPY 493/503 was determined to be 2.5 µg ml-1 and it can be used in combination with propidium iodide. The BODIPY 493/503 staining protocol has been used when analysing the morphology of the PHA-synthesising bacteria Halomonas halophila. Further, to study the UV-protective properties of PHA in Cupriavidus necator, another staining essay has been optimised. It has been established that the ROS sensitive dye CM-H2DCFDA gives better performance than its non-methylated form. Also, the UV-protective characteristics of the PHA-synthesising strain Cupriavidus necator H16 were confirmed when compared to its non-PHA synthesising strain C. necator PHB-4.
Keywords:
analýzy jedné buňky; Bakteriální autofluorescence; Cupriavidus necator; doba života excitovaného stavu; fluorescenční mikroskopie; Halomonas halophila; kvalita kontroly biotechnologických procesů; optimalizace fluorescenčního barvení; oxidativní stress; protektivní charakteristiky PHB; průtoková cytometrie; ROS; Sporomusa ovata; average fluorescence lifetime; Bacterial autofluorescence; biotechnological processes quality control; Cupriavidus necator; flow cytometry; fluorescence microscopy; fluorescence stain optimisation; Halomonas halophila; oxidative stress; PHB protective characteristics; ROS; single cell analysis; Sporomusa ovata
Institution: Brno University of Technology
(web)
Document availability information: Fulltext is available in the Brno University of Technology Digital Library. Original record: http://hdl.handle.net/11012/210152
guest ::
